结扎诱发的牙周炎大鼠模型炎症指标动态变化分析

任百洁，刘 悦，李雨阳，邹馨颖，孔 晨,王 雷

(吉林大学口腔医院牙周病科，吉林省牙发育及颌骨重塑与再生重点实验室，吉林 长春 130021)

牙周炎是造成牙齿松动的主要口腔炎症性疾病，牙菌斑是其始动因子。菌斑堆积引起多种炎症细胞因子大量分泌，激活破骨细胞，最后造成牙槽骨不可逆性吸收，出现牙齿松动、脱落[1,2]。抑制牙槽骨吸收，促进牙周组织再生已成为当今口腔医学研究的热点[3]。对于新型药物或者新型治疗方法的研发在临床试验阶段之前，必须经过动物实验。由于大鼠取材方便且操作简单，因此大鼠实验性牙周炎模型被大量应用于动物实验研究。

结扎丝诱导实验性牙周炎模型是建立牙周炎模型最普遍的方法之一[4]。与人牙周炎类似，实验性大鼠牙周炎模型中同样可以检测到炎症细胞因子大量分泌及牙槽骨大量吸收[5]。虽然结扎诱导的大鼠牙周炎模型被广泛应用于牙周炎的各类研究中，但缺乏对其炎症动态变化进行进一步的分析。此外，大鼠的龈沟上皮为角化上皮，与人类不同，其抗炎及自愈能力很强，因此大鼠与人的牙周炎的炎症动态变化可能略有不同[6]。笔者使用结扎诱导的实验性牙周炎模型评估大鼠牙周炎症动态变化，为后续对牙周炎模型的研究提供新的方向，为更好更准确地进行临床研究鉴定基础。

本研究通过观测大鼠体重变化，探究结扎丝的介入对炎症过程的影响，通过软垢指数、龈沟出血指数及牙齿松动度的监测，评估结扎21 d内目标牙牙周炎症变化，此外，为了更精确地评估炎症阶段牙槽骨的动态变化，使用断层扫描(CBCT)观察牙槽骨标本的显微三维(3D)结构图像，从而使被测样品复杂的结构数据化。通过上述研究手段，更精准地分析结扎诱发的大鼠实验性牙周炎模型的炎症动态变化。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要器械

6～8周雄性SD大鼠(吉林大学动物实验中心，中国)18只,体重(230±20)g。10%福尔马林、结扎丝(杭州奥索医疗器械有限公司，中国)；锥形束CT仪(CBCT)(Carestream Health,美国)。

1.2 方法

1.2.1建立牙周炎模型 参照Breivik等[7]的研究,采用单纯结扎法建立大鼠牙周炎模型,具体如下:大鼠称重，按每100 克体重腹腔注射麻药(10%水合氯醛)0.35 μL,仰卧位固定大鼠,开口器辅助开口，完整暴露上颌双侧第一磨牙,牙龈分离器分离牙龈,结扎丝环上颌第一恒磨牙1周后结扎固定,每只大鼠采取右侧侧结扎，左侧对照，结扎固定处以不妨碍大鼠进食及不破坏大鼠颊侧黏膜为准，最后确保结扎丝位于龈下,见图1。

1.2.2分组处理 SD大鼠健康,体重分布均匀，无疾患，饲养条件为(23±1) ℃、(60±5) %相对湿度和12 h明/暗周期。将大鼠其随机分成7组,每组3只,正常对照组不做任何处理，结扎组A～F分别结扎1、3、5、7、14、21 d后处死。此外，结扎组A～F大鼠均为右侧结扎，左侧不结扎，各分组操作流程如图1。实验操作都符合吉林大学动物伦理学及实验操作标准，并尽可能减少实验动物的数量，同时操作中减少刺激带来的不适，实验结束后动物以脱臼安乐死的方法处死，动物尸体委托学校动物中心处理。

注：黑色箭头所示为空白对照第一磨牙，白色箭头所示为目标牙结扎后，所示为各组处死时间图1 大鼠牙周炎模型及分组操作图Fig 1 Rat periodontitis model and grouping operation diagram

1.2.3体重及临床指标观察 大鼠适应性培养后，以大鼠结扎后第1天计为统计数据的第1天，每日于中午12点称重，直至处死，取平均值作为每一组结果进行统计。

简化软垢指数(debris index simplified,DIS)以视诊为主，辅助镰形探针，根据目标牙面软垢覆盖程度分级记分。0=牙面无软垢或着色；1=软垢覆盖牙面低于颈1/3,或牙面上出现外源性着色；2=软垢覆盖牙面1/3以上,但不超过牙面2/3；3=软垢覆盖牙面2/3以上,所有牙面软垢记分总和除以受检查牙面即为该患者的软垢指数分值)[8]。

龈沟出血指数(sulcus bleeding index,SBI)用钝头牙周探针放入龈缘下≤1 mm的位置,因腭侧更易观察，所以每牙选近中腭、腭侧、远中腭侧3个点,轻轻沿龈缘滑动后观察出血程度,取其均值作为此牙的龈沟出血指数。0表示龈缘和龈乳头外观健康,轻探牙龈沟后不出血；1表示龈缘和龈乳头呈轻度炎症,轻探龈沟后出血；2表示牙龈呈轻度炎症,有颜色改变,无肿胀或水肿,探诊后点状出血；3表示牙龈呈中度炎症,有颜色改变和轻度水肿,探诊后出血,血溢在龈沟；4牙龈呈重度炎症,不但有色的改变,并且有明显肿胀,探诊后出血,血溢出龈沟；5表示牙龈有色的改变,明显肿胀,有时有溃疡,探诊后出血或自动出血[9,10]。

牙齿松动度(tooth mobility,TM)[11]以目标牙向颊舌向松动为1分,患牙向颊舌向及近中远中向均松动为2分,患牙向颊舌向及近中远中向、垂直向均松动为3分。

1.2.4CBCT分析 结扎后按图1所示时间脊椎脱臼法处死大鼠。取双侧上颌骨,去除结扎丝及软组织后将标本固定于10%福尔马林溶液中并使用相机对组织进行拍照，然后使用CBCT (电压65 kV,电流2.2 mA,总剂量75 mm Gy·cm2)精确测量各组第一磨牙牙槽骨吸收情况并进行分析。各样本第一磨牙釉牙骨质界 (cemento-enamel junction,CEJ)至牙槽嵴顶 (alveolar bone crest,ABC)的距离作为ABL值，分别测量颊、腭侧的近、中、远6个位点,取均值作为牙槽骨吸收测量值[12]。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 大鼠体重记录

所有大鼠为随机分组，体重分布较为均匀(220～240 g)，正常对照组在观察的21 d内体重持续增长；其余结扎组在结扎后3 d体重均为下降趋势，第3天体重开始恢复上升。自3 d后各结扎组与正常对照组具有相似的体重增长率，各组实验3～21 d的体重增长率均在1.0%～1.1%范围内，差异无统计学意义(P>0.05)，见图2。说明由于结扎丝的介入，大鼠会出现3 d的适应性现象，而在结扎3 d后结扎丝即对大鼠生长发育不会产生影响。

注：红色示正常对照组21 d体重变化，黑色示结扎组A～F图2 大鼠体重记录图Fig 2 Rat weight record

2.2 临床指标结果分析

结扎侧与正常对照侧在未结扎前的DIS、SDI、TM均为0，正常对照侧在21 d内DIS、SDI、TM值无变化。结扎侧DIS在结扎后第1、3、5、7天较正常对照侧明显升高(P<0.05)，且DIS值在前3 d呈上升状态，第5天开始逐渐下降，直至结扎第21天下降至与正常对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)；结扎侧SDI在第5天明显升高，第7天达到峰值后逐渐下降(P<0.05)，直至结扎第21天与正常对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)；结扎侧TM第7天开始出现变化，直至第21天逐渐上升，与正常对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3、表1。

A～D依次为：正常对照侧第一磨牙、结扎后软垢、探针出血、牙龈萎缩，黄色箭头示软垢已覆盖目标牙，红色箭头示探诊后出血,血溢出龈沟，白色箭头示目标牙结扎后第一磨牙与第二磨牙间牙龈已出现萎缩，牙根部分暴露图3 临床指标检查图Fig 3 Examination of clinical indicators

表1 结扎组和正常对照组不同时间点DIS、SDI、TM值比较Tab 1 Comparison of DIS,SDI,and TM values at different time points between the ligation group and the normal control group(n=3,

2.3 CBCT检测结果

直视下可见目标牙牙槽骨吸收情况，结扎组A目标牙牙槽嵴顶近釉牙骨质界，周围骨质未吸收；结扎组D、E、F牙槽骨吸收量明显高于其余组，以第一磨牙与第二磨牙结扎区骨吸收最严重，见图4。CBCT统计学结果显示：结扎组A(0.34±0.13)、B(0.38±0.09)、C(0.44±0.08)的CEJ-ABC距离与正常对照组(0.35±0.11)比较，差异无统计学意义(P>0.05)，结扎组D(0.59±0.08)、E(1.00±0.25)、F(2.03±0.52)的CEJ-ABC距离明显高于正常对照组(P<0.05)，且F组与D、E组对比骨吸收更加明显，差异具有统计学意义(P<0.01)，见图5。

A～F依次为：结扎组A、结扎组B、结扎组C、结扎组D、结扎组E、结扎组F。白色箭头所示为目标牙，红色箭头所示为骨吸收。图4 上颌第一磨牙牙槽骨吸收图Fig 4 Alveolar bone resorption of maxillary first molar

注：横线表示两组间的比较，*P<0.05，***P<0.01图5 CBCT示CEJ-ABC距离的比较Fig 5 CBCT shows CEJ-ABC distance comparison

3 讨论

牙周炎是一种以牙齿松动为主要临床症状的慢性感染性疾病，最新研究发现，牙周炎除了与糖尿病、心脑血管疾病密切相关，还可能导致肝脏损伤及阿尔兹海默症，严重影响中老年人的身体健康[13,14]，所以牙周炎的研究对于人类健康至关重要。牙周炎是一个连续的炎症发展过程，分为4个时期：始发期、早期病变、病损确立期及进展期，每个阶段既互相联系、过渡，又各自相对独立[15,16]。始发期表现为急性渗出性炎症反应：龈沟上皮血管扩张，通透性增加，即出现龈沟探诊出血现象[17]。进展期为持续性的炎症破坏过程，深牙周袋形成、牙槽骨吸收破坏明显,此期临床可出现明显牙齿松动症状[18]。

本实验通过大鼠21 d动态体重变化联合不同时间点临床指标分析：所有结扎组大鼠体重变化在前3 d呈下降趋势，软垢指数在前3 d呈上升趋势，表明大鼠在结扎后进食及正常磨牙受结扎丝影响很大，造成软垢大量堆积，在结扎3 d后大鼠出现适应现象，恢复正常进食磨牙，体重逐渐上升，软垢指数也随着大鼠正常磨牙进食开始呈下降趋势，故结扎第3天是实验性牙周炎模型DIS值的峰值。随着软垢堆积，结扎的第一磨牙在第3天出现明显的探诊出血，即结扎第3天为牙周炎始发期。第7天达到SDI峰值，随后SDI值开始下降，故随着软垢堆积，在结扎后1周炎症达到峰值，故结扎后3～7 d为急性炎症期。随后，结扎第14天结扎侧出现明显的牙齿松动，且TM值从出现至21 d一直为上升状态，故推测结扎后两周，实验性牙周炎大鼠由急性牙周炎转为慢性牙周炎阶段，即为牙周炎的慢性进展期。

本实验结果证明结扎丝结扎后3 d诱发大鼠产生牙周组织炎症，即为牙周炎始发期；结扎诱发的实验性牙周炎在结扎的3～7 d处于急性炎症期；14～21 d转为慢性炎症阶段，为慢性牙周炎的进展期。

本实验首次根据炎症指标分析了结扎诱发的牙周炎大鼠的炎症动态变化，更加精细地定义了炎症始发期及进展期时间，为后续对大鼠牙周炎模型的研究提供了新的方向，为更好更准确地进行临床研究奠定基础。