仿生型复合补片在大鼠腹壁缺损中的应用研究*

王宪朋，郑晓霞，孙淑萌，英永，李文明，王勤，刘阳，尹弢

(山东省药学科学院 山东省医用高分子材料重点实验室，济南 250101)

1 引 言

腹部外伤、肿瘤切除、组织感染等均会造成腹壁缺损[1-2]，进而导致腹壁疝的发生。自Lichtenstein提出“无张力疝修补术”概念后[3]，补片材料迎来飞速发展[4-5]。然而，补片置入腹腔后，有与腔内脏器发生粘连的可能，甚至会引发较严重的并发症[6-7]。人工合成补片因价格低廉、来源广泛[8-10]，在临床使用中具有显著优势，但上市产品均存在过量瘢痕增生、粘连和术后慢性疼痛等缺陷[11-12]。为降低补片植入导致的粘连程度，本研究以一种仿生型复合补片为试验组与对照组聚丙烯网补片的动物试验结果进行了对比，评价脏器与腹壁修复区域的粘连优良率及新生血管生长、腹膜修复等情况。

2 材料和方法

2.1 试验动物、试剂与仪器

健康SD大鼠，SPF级，10只，订购体重160～180 g，试验时体重200 g左右，动物合格证号为37009200020173，由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供，饲养于万级屏障环境中。

聚丙烯网补片，日照天一生物医疗科技有限公司；仿生型复合补片，自制；SP-0023 HistostainTM-Plus Kits免疫组化试剂盒，上海瑞齐生物科技有限公司；Rabbit Anti-CD31单抗、DAB染色试剂盒，北京博奥森生物技术有限公司；戊巴比妥钠，25 g/瓶，德国默克公司；注射用青霉素钠，山东鲁抗医药股份有限公司；生理盐水若干。

荧光显微镜，Ni-U，日本尼康公司；石蜡切片机，RM2245，德国徕卡公司。

2.2 建立大鼠腹壁缺损模型

大鼠禁食12 h后，用1%戊巴比妥钠溶液行腹腔注射麻醉，腹部脱毛，常规消毒铺巾，取腹部正中位置切开皮肤及皮下组织，将皮下组织及深层筋膜钝性分离，肌层显露后切除掉两侧的腹壁肌肉及腹膜，在腹壁上形成1个约1 cm×1 cm的方形缺损，腹壁缺损模型建立完成。使用生理盐水对腹腔进行冲洗，将残余液体吸净后放置补片。对照组使用传统聚丙烯网补片，试验组使用仿生型复合补片，使用5-0丝线将补片固定于腹壁缺损肌肉边缘，然后用4-0丝线将皮下组织及皮肤间断缝合，无菌纱布对切口覆盖。尾部标记后单笼饲养。术后青霉素抗炎3 d，观察一般情况。

术后4周处死动物，开腹观察试验动物创面粘连情况并评分，观察创面愈合情况。同时取缺损部位2 cm进行组织学观察。

2.3 评价方法

2.3.1大体观察 术后每天肉眼观察试验大鼠的状态，包括缺损部位是否出现局部炎症、伤口裂开、感染等情况。

2.3.2粘连情况 参照国家药品监督管理局医疗器械技术审评中心发布的《腹腔内置疝修补补片动物实验技术审查指导原则》[13]，选用粘连强度、粘连面积为量化指标，评价补片植入4周后与腹腔内组织器官的粘连情况，进而对两个指标的量化得分进行综合评价。

以试验动物的粘连综合情况为标准，评价补片与脏器之间的粘连情况，粘连情况综合评价优或良即为临床可接受的粘连情况。以粘连情况评分为优或良的例数在总例数中的百分比为粘连情况优良率，见式(1)。

粘连情况优良率=

(1)

2.3.3病理检查 取修补区域腹膜组织，用4%多聚甲醛固定后，石蜡包埋切片，厚度5 μm。分别进行HE染色和Masson染色，于光镜下观察修复组织成纤维细胞的增殖效果，观察缺损部位胶原的形成。

CD31免疫组化染色：4%多聚甲醛固定后，石蜡包埋切片，抗原修复，3%去离子水孵育15～20 min。加入试剂A室温避光孵育20 min后，添加PBS适当比例稀释的一抗，4℃孵育过夜，PBS冲洗3次，每次3 min；添加试剂B室温避光孵育20 min，PBS冲洗3次，每次3 min；添加试剂C室温避光孵育20 min，PBS冲洗3次，每次3 min；显色剂显色；苏木素复染3 min，分化后自来水冲洗。脱水后，将切片由二甲苯中取出晾干，中性树胶封片后，显微镜镜检，收集图像。以CD31免疫组化染色结果评价新生毛细血管长入情况。

3 结果与讨论

3.1 大体观察

术后缝合部位出现红肿，3 d后红肿现象逐渐消失，试验组和对照组动物缝合区域均未出现局部炎症、明显隆起、伤口裂开、感染等情况。

3.2 粘连情况

选用粘连强度和粘连面积两个指标评价补片与腹腔内脏器的粘连程度，评分标准见表1。以粘连强度评分和粘连面积评分为依据，将粘连情况综合评价分为优、良、中、差四个等级，评分标准见表2。试验组4只动物仅有1处轻微粘连，一拉即开，粘连强度评分为1分，粘连面积占补片与组织接触总面积25%以下，粘连面积评分为1分。由表2可知，试验组4只动物的粘连情况综合评价为优；试验组1只动物无粘连发生，粘连情况综合评价为优。试验组粘连情况优良率为100%。对照组3只动物有多处粘连，尚能分离，粘连强度评分为2分，粘连面积占补片与组织接触总面积30%左右，粘连面积评分为2分。由表2可知，对照组3只动物的粘连情况综合评价为良；对照组2只动物有多处粘连，较难分离，粘连强度评分为3分，粘连面积占补片与组织接触总面积40%左右，粘连面积评分为2分，粘连情况综合评价为中。试验组粘连情况优良率为60%。

表1 粘连情况评分标准

表2 粘连情况综合评价表

补片植入4周后，试验组和对照组的粘连程度差异较明显，试验组和对照组腹腔内粘连情况观察结果见图1。由图1可知，试验组补片与腹腔内脏器几乎无粘连发生，而对照组动物腹腔内脏器与补片之间的粘连情况较明显。由此可见，仿生型复合补片较传统聚丙烯网补片具有优异的防粘连效果。这可能是因为，仿生型复合补片是由静电纺丝层、亲水层及支撑层构成，静电纺丝层起物理屏障作用的同时，亲水层中的亲水性材料为组织修复细胞提供更有利的生长和迁移环境[14]，促进成纤维细胞的适度增殖，加速腹膜化，从而有效抑制损伤部位和相邻脏器之间粘连的发生。

图1 试验动物腹腔内粘连情况

3.3 病理检查

对腹壁缺损部位的组织切片进行HE染色，并在光镜下观察其病理情况，结果见图2。图2中，试验组和对照组在低倍镜下(HE×20)均可观察到腹膜及腹膜下组织内已有肉芽组织形成，腹膜下组织内含多灶性大小不等的样品，未降解样品周围被纤维组织包裹。高倍镜下(HE×100)可见腹膜下组织内肉芽组织形成，组织内含多灶性大小不等的样品，样品未完全降解，周围被纤维结缔组织包裹，并有多核巨细胞形成。HE染色结果表明，试验组和对照组的成纤维细胞均生长良好，缺损部位肉芽组织均已形成。

图2 试验动物腹壁缺损部位HE染色结果

采用MASSON染色方法对腹壁缺损部位的胶原纤维进行表征，试验组和对照组的MASSON染色结果见图3。由图3可知，试验组腹膜下组织内含多灶性大小不等的样品，样品未完全降解，周围被纤维结缔组织包裹，组织内胶原纤维蓝染。对照组腹膜下组织内含未完全降解的样品，样品周围被纤维结缔组织包裹，组织内胶原纤维蓝染。MASSON染色结果表明，试验组和对照组缺损腹膜部位已有大量胶原生成，形成较为致密的纤维结缔组织。

图3 试验动物腹壁缺损部位MASSON染色结果(HE×100)

免疫组化法检测缺损部位组织CD31蛋白的表达，反映新生血管生成情况，试验组和对照组的CD31免疫组化染色结果见图4。由图4可知，试验组的腹膜下组织内有肉芽组织形成，组织内含未完全降解的样品，样品周围肉芽组织内含多量棕染的新生血管。而对照组中，肉芽组织内含少量棕染的新生血管。由此可见，试验组的新生血管情况优于对照组。

图4 试验动物腹壁缺损部位CD31免疫组化染色结果(HE×100)

缺损部位的胶原和新生血管生成情况可反映新生腹膜情况。相较于对照组，试验组能够更好地促进缺损部位的修复，加速新生腹膜的形成。这可能是因为仿生型复合补片具有优异的防粘连效果，抑制了成纤维细胞的过度增殖，从而为缺损部位间皮细胞、血管等的生长提供优良的修复环境。

4 结论

本研究考察了仿生型复合补片及聚丙烯网补片植入4周后脏器与腹壁缺损区域的粘连情况及腹壁缺损部位的修复情况。结果表明，试验组的粘连情况优良率显著优于对照组。病理检查结果显示，试验组和对照组的成纤维细胞均生长良好，缺损部位肉芽组织形成，两组均有新生胶原纤维和血管，但试验组的新生血管多于对照组，表明试验组缺损部位腹膜重新生长情况优于对照组。说明仿生型复合补片在修复缺损腹壁的同时，还具有较好的防粘连效果。