非小细胞肺癌中circHIPK3的表达及其临床意义

陈桂德,齐 林,戎雪冰

(1.河北省保定市第一医院，河北 保定 071000 2、河北省承德医学院研究生院，河北 承德 067000)

肺癌是世界上常见的恶性肿瘤且是癌症相关性死亡的重要因素。肺癌中约80～85%是非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)。尽管NSCLC的治疗药物和策略已经取得了很大的进展，但是NSCLC患者的五年总生存率仍然很低，这与其发现晚和早期转移有关。目前影像学检查很难精确的区分肺的良恶性病变。支气管检查活检和经皮穿刺虽然可获取病理组织增加了确诊率，但是有一定的适应症和导致呼吸困难、气胸、血胸和肿瘤出血等风险，费用高，增加了患者的痛苦和经济负担，限制了其应用。因此，找到高效的生物学标志物和治疗靶标对NSCLC的诊断治疗和预后有着重要的意义。近年来，环状RNA(circRNA)因其在恶性肿瘤形成和发展中的关键作用得到越来越多的关注。其在真核细胞中广泛表达，是一类单链RNA分子的内源性非编码RNA，参与转录和转录后水平的基因调控。CircRNA是共价连接形成的封闭环状结构，不具有5'帽和3'poly(A)尾巴。通过将上游3'剪接受体与下游5'剪供体连接起来而形成“反向拼接”结构。这种独特的闭合环状结构使其能够耐受核酸外切酶，比线性RNA同工型更加稳定，半衰期更长。越来越多研究证实circRNA通过调节肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡和侵袭等病理生理过程在肿瘤演变和进展的生物学过程中扮演着重要角色。研究显示，hsa-circRNA-103809通过miR-532-3p/FOXO4轴调控直肠癌的细胞增殖和迁移[1]。有研究证明，circAGFG1充当miR-195-5p海绵，通过调节CCNE1以促进三阴性乳腺癌进展[2]。有报道hsa-circRNA-101996通过抑制miR-8075激活TPX2表达来增加子宫颈癌的增殖和侵袭[3]。CircHIPK3在膀胱癌、胃癌、卵巢癌、肝癌、慢性粒细胞白血病、神经胶质瘤组织中高表达，与肿瘤增殖、侵袭和预后等相关[4,5]。而circHIPK3与NSCLC患者诊疗及预后的关系未见文献报道。在这项研究中，首先通过qRT-PCR确定了NSCLC手术切除的肿瘤组织和肿瘤旁正常组织及肿瘤患者血浆和健康体检者血浆中circHIPK3的表达水平，并评估了其临床病理学意义。受试者工作(receiver operating characteristic curve，ROC)曲线判断circHIPK3的敏感性和特异性，进一步研究circHIPK3与NSCLC患者生存率及预后的关系，从而判定circHIPK3可能是NSCLC的潜在生物标志物和治疗靶标。

1 材料与方法

1.1研究对象和临床标本收集：54例NSCLC组织和与之匹配的相邻正常肺组织样本(距肿瘤边缘≥3cm)是从2013年6月至2015年1月在保定市第一医院进行手术的NSCLC患者中收集的。手术标本立即保存在液氮中直至使用。收集以上患者及健康体检者的空腹外周静脉血静54例(两组年龄、性别和身体质量指数相匹配)，离心后保存至液氮中备用。所有患者均具有NSCLC的病理组织学诊断。所有参与本研究的人员都签署了知情同意书，并且获得保定市第一医院道德伦理委员会的批准。所有患者术前均未行化放疗并定期电话或到家随访。本研究遵守《赫尔辛基宣言》。依据世界卫生组织的TNM分期分类系统确定所有收集标本的临床分期。

1.2总RNA提取和逆转录，实时定量PCR:使用Trizol(Invitrogen)从组织样品中提取总RNA。RNA浓度和纯度使用NanoDrop ND-1000分光光度计(NanoDrop Technologies)进行测量。使用PrimeScriptTMRT试剂盒(TaKaRa，中国大连)合成cDNA。实时PCR分析是使用SYBR Green qPCR SuperMix-UDG (Life Technologies)和ABI 7500实时PCR系统(Applied Biosystems)。内参为GAPDH，每个样本3个复孔，至少3次独立的试验。circHIPK3表达比较使用ΔCt方法。Sangon Biotech (上海, 中国)合成引物序列(见表1)。

表1 引物序列

2 结 果

2.1circHIPK3在NSCLC癌组织和癌旁正常组织中的表达:在NSCLC中，circHIPK3表达水平在癌组织较癌旁正常肺组织表达显著增加(P<0.001)，见图1。

图1 circHIPK3在NSCLC癌组织、癌旁正常肺组织中的表达(P<0.001)，较高的ΔCt值表示较低的circHIPK3表达。

2.2circHIPK3在NSCLC患者血浆和正常体检者血浆中的表达：circHIPK3在NSCLC患者血浆较正常体检者血浆表达显著增加(P<0.001)，见图2。

图2 circHIPK3在NSCLC患者血浆、正常体检者血浆中的表达

2.3circHIPK3与NSCLC临床病理特征之间的关系:NSCLC癌组织中circHIPK3表达较对照组显著增高，进一步分析癌组织circHIPK3表达和临床病理特征的关系。在NSCLC组织中，circHIPK3与患者肿瘤组织分化、临床分期和淋巴结转移有显著差异(P<0.05)，而与年龄、性别、病理分型无显著差异(P>0.05)(表2)。组织分化差、临床分期晚和淋巴结转移者circHIPK3表达高。

表2 非小细胞肺癌circHIPK3的表达和临床病理参数的关系

2.4circHIPK3在NSCLC临床诊断中的潜在价值:通过ROC曲线评估其作为生物学诊断指标的潜在价值。ROC曲线面积越大，其诊断价值越大。

2.4.1NSCLC癌组织中circHIPK3表达水平的ROC曲线:ROC曲线下面积为0.890(95%置信区间：0.826～0.953，P<0.001)。约登指数的最大值约为0.648，灵敏度=90.3%，特异度=68.5%，见图3。

2.4.2NSCLC患者血浆中circHIPK3表达水平的ROC曲线：ROC曲线下面积为0.829(95%置信区间：0.889～0.948，P<0.001)。约登指数的最大值约为0.611，灵敏度=79.6%，特异度=83.3%，见图4。

2.5circHIPK3表达与NSCLC患者预后的关系：依据NSCLC组织circHIPK3相对表达量中位数4.637，将患者分为circHIPK3高表达组32例和低表达组22例。两组均随访5年，死亡23例，其中低表达组6例，高表达组17例。运用Kaplan-Meier法和Log-rank检验分析circHIPK3表达与NSCLC患者术后5年存活率的关系，circHIPK3高表达和低表达患者5年累积生存率分别为46.9%、72.7%，circHIPK3阳性表达患者术后生存时间较阴性患者明显缩短(χ2=3.657，P=0.026),差别有统计学意义，见图5。

2.6NSCLC患者预后的Cox比例风险回归模型的多因素分析：Cox多因素回归分析表明，circHIPK3、组织分化程度、临床分期和淋巴结转移是影响NSCLC预后的独立危险因素，见表3。

表3 Cox比例风险回归模型的多因素分析

图3 NSCLC癌组织circHIPK3表达水平的ROC曲线

图4 NSCLC血浆circHIPK3表达水平的ROC曲线

图5 circHIPK3高表达和低表达患者的生存曲线

3 讨 论

NSCLC的治疗近来快速发展，但总体治疗效果不佳。寻找新的分子生物标志物和治疗靶标对NSCLC的诊疗具有重要的现实意义。

CircRNA根据所包含序列的不同，分为内含子CircRNA、外显子CircRNA、外显子-内含子CircRNA三类。CircRNA最初被认为是异常剪接无功能的副产物，然而随着分子生物学技术发展和研究的深入，越来越多证据揭示CircRNA在肿瘤的形成和进展中起到了重要的作用。CircRNA通过发挥miRNA的海绵样作用、circRNA-蛋白质作用等机制发挥作用。

CircRNA在生物的病理和生理调控过程中扮演者重要角色。包括癌症在内的多种疾病中circRNA表达异常。CircRNA异常表达与各种癌症的恶性行为相关。有研究表明，circ ADAMTS13在肝细胞癌中上调，可抑制肝细胞癌的细胞增殖[6]。有研究证实，直肠癌中circVAPA上调抑制正常癌细胞的生长过程[7]。还有研究显示circRNA-0001283通过MiR-187 / HIPK3轴抑制乳腺癌的增殖和侵袭[8]。本研究中，NSCLC患者circHIPK3表达在癌组织中较癌旁正常组织显著增加，在患者血浆较健康体检者显著增加。NSCLC患者组织circHIPK3的表达水平与肿瘤组织分化、临床分期、淋巴结转移等临床病理特征相关。以上提示circHIPK3促进NSCLC的进展。

CircRNA有可能成为恶性肿瘤诊断和预后的潜在的生物分子标志物。有研究报道，circFoxO3a的低表达与肿瘤更深的基质浸润和淋巴结转移阳性有关，且血浆circFoxO3a表达较低的宫颈癌患者预后较差，其可以作为鳞状宫颈癌潜在的新型无创性预后生物标志物和治疗靶标[9]。有研究发现，circHIPK3的过表达在体外显著抑制了骨肉瘤细胞的增殖，迁移和侵袭，circ-HIPK3可能成为骨肉瘤诊断和治疗靶标的新型潜在生物标志物[10]。还有研究证明hsa-circ-0001649在直肠癌中下调，与癌组织病理分化呈负相关，是直肠癌潜在的新型生物标志物[11]。本研究中，NSCLC组织circHIPK3的ROC曲线下面积为0.890，灵敏度=90.3%，特异度=68.5%；NSCLC患者血浆circHIPK3的ROC曲线下面积为0.829，灵敏度=79.6%，特异度=83.3%。而血清CEA、SCC-Ag对NSCLC的诊断特异性较高，可能超过90%，但它们的敏感性低，易导致漏诊和延误治疗。以上提示circHIPK3有可能成为NSCLC诊断的生化标志物。此外，NSCLC癌组织circHIPK3表达水平与肿瘤组织分化、临床分期、淋巴结转移相关，高表达患者有较低的生存率。Cox回归分析表明，circHIPK3高表达是NSCLC预后差的独立的危险因素。以上提示circHIPK3促进肿瘤进展并影响其预后，有可能作为评估NSCLC预后的生物标志物和治疗靶标。

抽血检验分子标志物简便易行、风险低、痛苦小、花费低，是理想的检验手段。但目前临床检测NSCLC的肿瘤标志物，如癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、鳞状细胞癌抗原(squamous cell carcinoma antigen，SCCA)、糖类抗原125(carbohydrate antigen 125，CA125)、糖类抗原153(carbohydrate antigen 153，CA153)等，灵敏度低和特异性差，无法满足临床的需求。CircRNA在细胞中含量丰富，高度保守，具有组织特异性表达，而且非常稳定，是理想的诊疗和预后的生物分子标志物。此外，支气管镜或经皮穿刺活检获得的组织行病理联合circHIPK3检测，能够提高NSCLC的确诊率。CircHIPK3在NSCLC患者癌组织和血浆中表达水平显著增高，且与NSCLC患者预后相关，均提示circHIPK3有可能是NSCLC的诊疗的分子标志物和潜在的治疗靶标。

本研究的局限性在于样本量小，实验结果需扩大样本量进一步证实，并且circHIPK3在NSCLC的作用机制需进一步研究。多数NSCLC就诊晚和早期发生的淋巴结转移是NSCLC治疗效果不佳的重要原因。在真实世界中，临床缺乏NSCLC诊疗更有效的方法和药物。因此，寻找更高效、敏感的生物学标志物和治疗靶标成为亟待的需求。CircHIPK3有可能成为NSCLC诊断和预后生物学标志物的潜在靶标，为肺癌的诊疗提供新的思路，对促进基础circRNA研究转化为临床应用具有重要的意义。