地骨皮甲素调节VEGF信号通路对分泌性中耳炎大鼠的作用研究

卡迪丽娅·木拉提，艾力根·阿不都热依木，张 瑾

0 引言

分泌性中耳炎(Otitis media with effusion，OME)是以中耳积液及听力下降为特征的中耳非化脓性炎性疾病，又称为渗出性中耳炎或卡他性中耳炎，为耳鼻喉科常见疾病。泼尼松是临床上治疗分泌性中耳炎常用的一种糖皮质激素类药物，因其不良反应较多而不宜长期使用[1-3]。地骨皮甲素是一种从中药地骨皮中分离出的生物碱类物质，研究表明，地骨皮具有抗兴奋性神经毒性、抗氧化应激、抗炎、抗肿瘤等药理作用[4-7]。本文通过研究地骨皮甲素对分泌性中耳炎大鼠的作用及机制，为分泌性中耳炎的临床治疗提供新的参考及依据。

1 材料与方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠72只，SPF级别，6周龄，体重(180±20)g，购于新疆医科大学动物实验中心，购买后进行72 h适应性饲养，自由进食、饮水。地骨皮甲素购买于成都普瑞法科技开发有限公司，卵清蛋白(Ovalbumin，OVA，Ⅴ级)购自美国Sigma公司，VEGF、VEGFR-2和GAPDH抗体均购自Proteintech公司，RIPA蛋白裂解液购自上海碧云天公司，IFN-γ、IL-4、TNF-α、IL-6及IL-1β ELISA检测试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司，ECL显色液购自Thermo公司，全自动生化分析仪购自北京岛津公司，双垂直电泳仪、转印电泳仪、凝胶成像仪均购自伯乐生命医学产品有限公司。

1.2 分泌性中耳炎大鼠模型的建立及给药 全部大鼠在电耳镜下检查，排除外耳道及中耳感染。将大鼠随机分为6组，每组12只，分别为对照组、模型组、地骨皮甲素低剂量组、地骨皮甲素中剂量组、地骨皮甲素高剂量组及泼尼松组，除对照组外，其余各组参照文献方法[8-9]建立分泌性中耳炎大鼠模型。具体方法为：将1.2 mg OVA溶于0.6 ml磷酸缓冲液(Phosphate buffer solution，PBS)，再以5.14 mg氢氧化铝溶于0.6 ml PBS作为免疫佐剂对大鼠行腹腔注射，第8天重复注射1次，此为全身致敏阶段;第15天用10%水合氯醛15 mg/kg对大鼠行腹腔注射麻醉，在手术显微镜下经鼓膜以微量进样器将0.1 mg OVA溶于35 μl PBS后注入大鼠中耳腔，第16天再次麻醉，耳内镜观察鼓膜情况，并重复第2次注射，此为耳内激发阶段，制成OME模型。耳镜检查发现鼓膜明显内陷、红斑，部分可见液平面及中耳内气泡形成，视为造模成功。

造模完成后，根据大鼠体重，对照组及模型组按照20 ml/kg灌胃给予生理盐水，地骨皮甲素低、中、高剂量组按照20 ml/kg分别灌胃给予大鼠0.5 mg/ml、1 mg/ml、2 mg/ml的地骨皮甲素，泼尼松组按照20 ml/kg灌胃给予大鼠0.25 mg/ml的泼尼松，所有组别每天定时给药1次，连续给药21 d，最后一次给药24 h后，进行后续实验。

1.3 大鼠血清TNF-α、IL-6及IL-1β水平的测定 对各组大鼠通过眼眶静脉丛取血至干净离心管中，于4 ℃静置4 h，然后置于离心机中，4 ℃，3 500 r/min离心10 min。取上清液，按照ELISA试剂盒说明书检测大鼠血清TNF-α、IL-6及IL-1β水平。

1.4 大鼠中耳灌洗液中IFN-γ、IL-4水平测定 参照文献方法[9]，每组取6只大鼠，断头处死后，取出听泡，自听泡钻孔，以50 μl PBS灌洗中耳腔3次并收集灌洗液共150 μl，于4 ℃以4 000 r/min离心10 min后，取上清液冻存于-20 ℃备用，按照ELISA试剂盒说明书检测中耳渗液中IFN-γ、IL-4水平。

1.5 组织样本的采集及组织蛋白的提取 大鼠颈椎脱臼处死后迅速分离大鼠中耳组织，然后将一部分中耳组织放入10%中性甲醛中固定，其余部分放入玻璃匀浆器中，加入RIPA蛋白裂解液，用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解，置于4 ℃离心机以12 000 r/min离心10 min，用移液枪将上清液移至另一干净离心管中，并向其中加入SDS loading buffer，混匀后放入100 ℃水浴5 min，然后放入-20 ℃冰箱储存备用。

1.6 苏木精-伊红染色(Hematoxylin-eosin staining，HE染色) 将在10%中性甲醛中固定24 h后的中耳组织转移至75%的酒精中，经自动组织脱水机脱水、透明处理，在石蜡包埋机中浸蜡、包埋，进行5 μm切片，水浴展开，捞片，沥干，放恒温箱中烘干，置于烘箱中60 ℃烤2 h，常规HE染色，在显微镜下进行组织病理学观察。HE染色步骤：①脱蜡:将石蜡切片依次置于二甲苯(I)5 min→二甲苯(Ⅱ)5 min;②复水：依次置于100%乙醇2 min→95%乙醇1 min→80%乙醇1 min→75%乙醇1 min→蒸馏水洗2 min，各2次,然后把水吸干;③苏木精染色：置于苏木精溶液中2 min，自来水流水冲洗2 min，把水吸干;④分化：1%盐酸乙醇分化30 s，自来水浸泡15 min，吸干水;⑤伊红染色:置于伊红溶液中2 min;⑥脱水:依次置于95%乙醇(I)5 min→95%乙醇(Ⅱ)5 min→100%乙醇(I)5 min→100%乙醇(Ⅱ)2 min;⑦封片：置于通风橱，待乙醇彻底干后依次置于二甲苯(I)5 min→二甲苯(Ⅱ)5 min，待载玻片上残留二甲苯挥干后用中性树胶封片。

1.7 Western blot实验 将冻存的大鼠中耳组织蛋白液于室温下融化后，采用BCA法测定蛋白浓度，处理好待测样品后，取50 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳分离，转膜，将分离的蛋白电转移至PVDF膜上。封闭液室温封闭1 h，经VEGF、VEGFR-2及GAPDH抗体(1∶1 000)4 ℃孵育过夜。PBST充分洗膜后，加入二抗(1∶2 000)室温孵育1 h，PBST清洗后显色液显影，利用凝胶成像仪成像后，进行灰度值检测。

2 结果

2.1 地骨皮甲素对分泌性中耳炎大鼠血清TNF-α、IL-6及IL-1β水平的影响 各组大鼠血清TNF-α、IL-6及IL-1β水平见表1。结果表明，与对照组比较，模型组大鼠血清TNF-α、IL-6及IL-1β水平显著升高(P<0.05)，提示分泌性中耳炎大鼠存在病理性全身炎症反应;与模型组比较，地骨皮甲素各剂量组及泼尼松组大鼠血清TNF-α、IL-6及IL-1β水平均显著降低(P<0.05)，且随着地骨皮甲素剂量的增加，地骨皮甲素各剂量组TNF-α、IL-6及IL-1β水平逐渐降低。

表1 各组大鼠血清TNF-α、IL-6及IL-1β水平(n=12)

2.2 地骨皮甲素对分泌性中耳炎大鼠中耳灌洗液中IFN-γ、IL-4水平的影响 各组大鼠中耳灌洗液中IFN-γ、IL-4水平见表2。

表2 各组大鼠中耳灌洗液中IFN-γ、IL-4水平(n=6)

结果表明，与对照组比较，模型组大鼠中耳灌洗液中IFN-γ水平显著降低(P<0.05)，IL-4水平显著升高(P<0.05)，提示中耳灌洗液IFN-γ、IL-4水平可能与大鼠分泌性中耳炎大鼠发病机制密切相关;与模型组比较，地骨皮甲素各剂量组及泼尼松组大鼠中耳灌洗液中IFN-γ水平显著升高(P<0.05)、IL-4水平显著降低(P<0.05)，且随着地骨皮甲素剂量的增加，地骨皮甲素各剂量组大鼠中耳灌洗液中IFN-γ、IL-4水平变化表现出一定的剂量依赖性。

2.3 病理学检查 各组大鼠中耳黏膜组织病理学检查结果见图1。结果表明，与对照组比较，模型组分泌性中耳炎大鼠中耳黏膜细胞肿胀，黏膜增厚，可见炎症细胞浸润及多处细胞脱落，提示造模成功;与模型组比较，地骨皮甲素低、中剂量组分泌性中耳炎大鼠中耳黏膜肿胀情况好转，少见黏膜细胞脱落，地骨皮甲素高剂量组中耳黏膜较完整，细胞肿胀明显好转，偶见黏膜细胞脱落，泼尼松组分泌性中耳炎大鼠黏膜增厚基本消失，偶见细胞肿胀。

图1 各组大鼠中耳黏膜组织病理学检查结果(20×)注：A.对照组;B.模型组;C.地骨皮甲素低剂量组;D.地骨皮甲素中剂量组;E.地骨皮甲素高剂量组;F.泼尼松组

2.4 地骨皮甲素对分泌性中耳炎大鼠中耳黏膜VEGF、VEGFR-2水平的影响 各组大鼠中耳黏膜VEGF、VEGFR-2水平见图2。结果表明，与对照组比较，模型组分泌性中耳炎大鼠中耳黏膜VEGF、VEGFR-2水平显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)，提示VEGF信号通路的过度激活可能与大鼠分泌性中耳炎发病机制密切相关;与模型组比较，地骨皮甲素各剂量组及泼尼松组大鼠中耳黏膜VEGF、VEGFR-2水平均显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)，且随着地骨皮剂量的增加，VEGF、VEGFR-2水平逐渐降低，即表现出一定的剂量依赖性。

图2 各组大鼠中耳黏膜VEGF、VEGFR水平(n=6)注：*与对照组比较，P<0.05;#与模型组比较，P<0.05

3 讨论

OME的定义为不伴急性中耳炎症状和体征的中耳积液。OME具有一定的自限性，但约30%～40%患者会反复发作，其中又有5%～10%的患者发作时间持续≥1年。OME引起的持续中耳积液会降低鼓膜活动度，阻碍声音传导。目前临床上主要采用咽鼓管吹张、鼓膜穿刺、鼓膜置管、腺样体切除术等对症治疗，使用抗菌药物、糖皮质激素、黏液促排剂、鼻腔减充血剂等药物进行病因治疗，但这些药物会引起诸多不良反应，不宜长期应用[1-3]。

地骨皮甲素是一种从地骨皮中分离出的生物碱类物质，具有抗兴奋性神经毒性、抗氧化应激、抗炎、抗肿瘤等药理作用，并能够抑制NF-κB通路及AP-1的活化，保护大鼠海马体及预防大鼠因辐射诱发神经炎[4-7]。

VEGF信号通路是参与肿瘤血管生成的重要信号通路。近年来研究表明，VEGF信号通路异常激活与肺癌、乳腺癌、胃癌、胆囊癌、结直肠癌、宫颈癌等多种肿瘤疾病的发生发展密切相关[10-14]。研究表明，分泌性中耳炎大鼠中耳组织中VEGF信号通路表达异常，其发病机制可能与VEGF信号通路异常激活改变了大鼠中耳组织血管通透性有关[15-18]。

本文通过采用注射卵清蛋白的方法建立分泌性中耳炎大鼠模型。结果表明，与模型组比较，地骨皮甲素各剂量组及泼尼松组大鼠血清TNF-α、IL-6及IL-1β水平、中耳灌洗液中IL-4水平均显著降低，而中耳灌洗液中IFN-γ水平显著升高，且与地骨皮甲素的剂量呈依赖性;提示地骨皮甲素能够呈剂量依赖性地显著降低分泌性中耳炎大鼠血清炎症因子水平，缓解分泌性中耳炎大鼠中耳炎症状态，改善疾病进展，同时可能通过诱导大鼠中耳组织IFN-γ的产生，上调Th1型免疫应答，抑制Th2细胞的增殖，减少Th2炎性介质的释放，进一步抑制分泌性中耳炎大鼠中耳组织嗜酸性粒细胞的聚集，缓解中耳组织炎症状态;病理学检查结果表明，与模型组比较，地骨皮甲素低、中剂量组分泌性中耳炎大鼠中耳黏膜肿胀情况好转，少见黏膜细胞脱落，地骨皮甲素高剂量组中耳黏膜较完整，细胞肿胀明显好转，偶见黏膜细胞脱落，泼尼松组分泌性中耳炎大鼠黏膜增厚基本消失，偶见细胞肿胀，提示地骨皮甲素能够明显改善分泌性中耳炎大鼠中耳黏膜组织病理学改变，缓解分泌性中耳炎大鼠的疾病状态并改善疾病进展;Western blot结果表明，与模型组比较，地骨皮甲素各剂量组及泼尼松组大鼠中耳黏膜VEGF及VEGFR-2水平均显著降低，且与地骨皮甲素的剂量呈一定的依赖性，提示地骨皮甲素能够呈剂量依赖性地降低分泌性中耳炎大鼠中耳黏膜VEGF、VEGFR-2水平，调节大鼠中耳黏膜VEGF信号通路相关蛋白的表达，进而改善分泌性中耳炎大鼠的疾病状态。

综上所述，地骨皮甲素能够缓解分泌性中耳炎大鼠的疾病状态，改善大鼠疾病转归，其作用机制可能与其调节VEGF信号通路有关。