基于SSR标记的大麦种质资源遗传多样性分析

秦丹丹，杜 静，许甫超，徐 晴，葛双桃，彭严春，董 静*

（1.湖北省农业科学院粮食作物研究所/粮食作物种质创新与遗传改良湖北省重点实验室，湖北武汉430064；2.长江大学，湖北荆州434200）

大麦是世界也是我国第四大谷类作物，具有食用、饲用、酿造、保健等多重用途。但是，长期以来，我国的大麦生产自给率较低、对外依存度高。根据海关数据，2019年1—11月，我国从加拿大、澳大利亚等大麦主要出口国进口大麦596万t。自2020年5月19日起，我国对原产于澳大利亚的进口大麦征收反倾销税。这项举措既为大麦育种工作者提供了机遇，同时也提出了挑战。现阶段，为快速有效地将我国大麦从长期依赖进口的困境中解脱出来，保障国家粮食安全和社会稳定，优异专用型大麦新品种的培育工作仍然是育种工作者工作中的重中之重。

在大麦新品种选育过程中，对种质资源进行鉴定和评价是首要任务。在分子水平上对其进行遗传多样性分析，了解其亲缘关系远近，有助于我们更有针对性地、更准确地选择杂交亲本，在后代中获得优良变异，从而为大麦杂种优势利用及新品种选育提供可利用的信息[1]。随着Saghai-Maroof等首次利用4个简单重复序列（simple sequence repeat，SSR）标记对207份大麦种质的遗传多样性进行研究[2]后，AFLP[3]、RAPD[4]、SSR[2]以及新近发展的SNP[5]等各种类型的分子标记在大麦遗传多样性研究中都得到了应用。其中，SSR标记为共显性标记，因其多态性高、数目多、操作简单、易于鉴别、价格便宜等优点而在大麦的遗传多样性研究中被国内外学者广泛应用[6-9]。

本研究在对416对SSR引物进行筛选的基础上，利用其中多态性稳定可靠、条带清晰的53对SSR分子标记对157份国内外大麦种质资源（多为长江中下游麦区选育品种，包含笔者所在单位自育品种）进行了遗传多样性分析，旨在从分子水平上揭示笔者所在单位所收集保存的大麦种质间的亲缘关系，为后期杂种优势利用及突破型大麦新品种选育工作提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

本研究参试材料为157份来源于国内外的大麦种质资源，以长江中下游麦区自育品种为主，其中来自湖北省（鄂系列、华系列、楚系列、荆系列等）、江苏省（苏系列和扬系列）、浙江省（浙系列）和河南省（驻系列）的材料分别有34、14、6和9份，均由湖北省农业科学院粮食作物研究所麦类育种课题组收集、创制和保存，材料名称详见表1。

1.2 SSR分子标记的扩增方法

田间取各材料新鲜健壮的叶片，采用CTAB法提取DNA，SSR引物来源于Graingene（http://wheat.pw.usda.gov/GG3），由上海英骏公司合成。10μL的PCR扩增反应体系中包含模板DNA（50 ng/μL）1.0～1.5μL，正向引物（10μmol/L）和反向引物（10μmol/L）各1μL，2×Takara Master Mix 5μL，ddH2O 1.5～2.0μL。PCR扩增程序为：94℃5 min；35个循环的程序为94℃30 s，58℃30 s，72℃30 s；最后72℃延伸5 min。PCR产物采用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并通过硝酸银染色法显色。

1.3 带型统计和分析

将SSR分析中的任一扩增带看作一个等位位点，根据多态性引物扩增条带的有无，有带的记为“1”，无带的记为“0”，建立1，0型二元数据矩阵。采用Nei-li指数法，计算样本间遗传相似系数（GS）[12]。GS=2Nij/（Ni+Nj），式中：Nij是指材料i和j共有的片段数目；Ni和Nj分别为材料i和材料j中出现的片段数目。用NTsys 2.10e软件，根据非加权平均值的方法，绘制基于遗传距离的算术平均值的非加权对群方法（Unweighted Pair-Group Method Using Arithmetic Averages，UPGMA）聚类图，用于群体间遗传关系分析。

2 结果与分析

2.1 引物筛选

本研究首先利用来源差异较大的24份大麦种质对416对SSR引物进行筛选。根据分型结果，共筛选出117对扩增条带清晰、稳定性好且差异明显的多态性引物。在157份大麦种质中对这117对引物进行分析，结果发现，其中54对引物在较大群体中仍然表现为多态性稳定，大麦的1H～7H染色体上分别有7、7、6、8、8、8和10条（表2），将这部分结果用于后续遗传多样性分析。

表2 54对SSR引物序列、位置及扩增产物数目

续表

2.2 引物在供试材料中的多态性位点信息

进一步对54对多态性引物在大麦种质资源中的扩增和分型结果进行分析发现，每对引物的扩增产物为1～7条带，如Bmag0206扩增产物只有1条带，Ebmac0701扩增产物有6条带，而Bmag0496扩增产物多达7条（表2）。54对引物共扩增出188条清晰可辨的条带，其中172条具有多态性（表2），多态性比率为91.5%。

2.3 供试材料的聚类分析

根据SSR分析所得的1,0型数据聚类并作图（图1），由聚类图可见，相似系数分布范围为0.542 8～0.930 4。其中，G033T034U和永4783遗传相似系数最高，为0.930 4，表明两者亲缘关系最近。城间大麦和通99-36遗传相似系数最低，为0.542 8，两者亲缘关系最远。为了更好地表示157个品种之间的亲缘关系，在遗传相似系数GS≥0.665 7，将供试的157份大麦种质分成了5大类。

第一大类共包括6份材料，有Morex、GAMMA、城间大麦、PALLLDUM、ODESSKIY和鄂大麦9706。

第二大类共包括29份材料，有鄂大麦10号、创大麦43、广丰3号、扬农啤5号、驻5-189、扬农啤1号、扬农啤6号、03IN9-42、Harrington、甘垦5号、G033T034U、永4783、G033T059U、G033T025U、驻96005矮裸、日喀则-2、03IN5-212、扬农啤8号、Ecjotic、03IN5-156、03IN5-180、日喀则-1、日喀则S-1、ZDM9950、日喀则S-2、03IN5-20、苏啤4号、品5804和Manker。

第三大类共包括15份材料，有华大麦4号、华2236、华2539、永4564、荆02-248、驻97017-2-1、东84342-1、DMAS004、浙皮1号单、扬农啤8号*、扬农啤8号**、Z134V065W、甘肃2012引、Z212V009W和cherron。

第四大类共包括45份材料，由2个亚类组成。第一亚类有Djerlo、03IN5-232、BADORIY、驻大麦7号 和03IN5-298。第 二 亚 类 包 括 华2151、Z212V025W、S-192、华2328、凤 大 麦7号、Z188V023W、鄂大麦9号、浙5819、太福1号、甘垦6号、华2162、莆系14、闽保、03京2025-2026、莆大麦7号、华2114、XYL-601、鄂大麦7号、G231M004M、扬农啤9号、Kharkovski、矮单2-8、矮壮21、申河085、驻大麦5号、浙3521、苏啤3号、驻大麦5号*、关东黄金、苏啤6号、驻大麦998、浙3521*、云大麦2号、WDM7127、驻大麦6号、墨P、甘啤5号、WDM7140、通99-36和G049T060U。

第五大类共包含62份材料，也由2个亚类组成。第一亚类包括华2005、鄂大麦8号、鄂大麦68231、鄂大麦766、鉴75、陕引1号、C54S-1皮、闽诱3号、JB05-06、C54S-1蓝、85G46、鄂大麦883、楚0709、鄂大麦065、YN21、Goldenpromise、闽麦2号、花11、二芒大麦、酿造二条*、浙08-92、花30、扬农啤7号、青海-4、青海-6、杭农-81、Athes、entry26、单二、扬辐6008、鄂大麦886、云南-1、酿造二条、鄂大麦507、蒲09019、鄂大麦610、鄂6741、鄂大麦588、AcStephen、BBD-40、凤18-11和鄂啤2号，共42份材料。第二亚类包括华2759、鄂大麦6号、扬农啤2号、楚大麦38、品比5755、荆02-461、华2255、驻3-257、保大麦12号、乌金3号、浙07-6、扬农啤4号、云饲麦1号、华大麦12、I-2、楚09-05、华10118、华2908、03IN5-152和03IN5-154，共20份材料。

3 结论与讨论

种质资源的筛选、鉴定和评价是进行作物遗传改良的基础，而分析现有种质资源的遗传多样性，尤其是在分子水平上，有助于我们更精准地了解材料间的亲缘关系，从而有选择性地开展亲本组配工作。本研究在对400余对SSR引物进行初步筛选的基础上，挑选出54对多态性稳定且清晰可辨的引物，这些引物均匀分布在大麦1H～7H染色体上，基本覆盖大麦的整个基因组，具有一定的代表性。随后利用这54对SSR标记对157份国内外大麦种质资源进行了遗传多样性分析，以期为本单位的大麦新品种选育工作提供依据。虽然AFLP[3]、RAPD[4]、SSR[2]以及新近发展的SNP[5]等各种类型的分子标记在大麦遗传多样性研究中都得到了应用，但是SSR仍是目前进行大麦遗传多样性初步分析中首选的标记类型，并被广泛应用于大麦DUS测定[13]、农艺性状[14]、抗旱性[15]、耐盐性[16]以及抗病性[17]等性状的关联分析等研究。

虽然国内外学者利用SSR标记开展了多项关于大麦不同种质遗传多样性的研究，但是各研究所选的SSR标记却大不相同，很少有共同的标记。本研究筛选出的54对引物中，与部分其他研究相比，如92个用于分析108份青稞亲本材料的SSR标记[14]、27对用于分析我国西藏与中东地区近缘野生大麦遗传多样性的SSR标记[18]、用于分析61个国家2 625份大麦种质遗传多样性的35对SSR引物[19]和42对用于分析以色列不同地区的144份野生大麦遗传多样性的SSR标记[20]，都分别只有5～6个共同标记。这些研究相互之间的共同标记数目也很少，一方面可能是由于各单位所保存的SSR标记中相互间共同的本身就比较少，另一方面也可能是由于所选用的材料来源范围不同。目前，为了避免不必要的重复，更高效地评价大麦种质的遗传多样性，笔者认为，在未来的工作中，还急需筛选一套通用的、科学的、具有代表性并可用于评价种质真实性或者多样性的SSR引物。

本研究发现本课题组所保存的拥有相同名称的材料，在聚类分析中可能处于不同类，如扬农啤8号、扬农啤8号*和扬农啤8号**分别属于第二大类和第三大类（图1）。这些材料系不同年份从不同地点或单位引进的，它们在分子水平上的差异一方面可能是由于各单位相互引种时存在偏差，另一方面也可能是材料在保存或繁殖过程中出现了混杂。

与多数聚类分析结果[21-22]类似，本研究也发现聚类结果与材料的来源相对一致，如来自湖北省农业科学院的鄂大麦品种（系）除鄂大麦10号、鄂大麦7号、鄂大麦9号、鄂大麦6号外，都聚在第五大类第二亚类。第五大类还包含了另外的湖北省自育品种，如荆系列和华系列。而来自西藏日喀则地区的大麦品种聚在第二大类，来自河南省的驻大麦品种（系）大多聚在第四大类，少数的国外品种夹杂在各个类群中。说明国内的大麦育种普遍存在遗传基础相对单一的问题，这种现象不利于灾害严重年份中大麦稳产，在生产上具有一定的风险。这就要求在育种中加强外来种质资源的利用，扩宽遗传基础。事实上，近年来，国内的各大麦育种单位包括笔者所在团队也多次从加拿大、澳大利亚等大麦主要出口国引进部分优异种质资源。但是，从笔者所在团队的育种实践来看，受国内外生态环境不同的影响，这些种质在当地的表现可能与品种本来的表现不同。例如，从加拿大引进的种质就存在普遍偏高的缺点，导致这些种质很难在育种中直接利用。针对这些种质，我们一方面应该进行多年的综合农艺性状评价，另一方面，也需要对其进行分子层面上的解析，通过分子标记辅助育种或者基因编辑等策略有目的地进行利用。