玉米ZmRab6A基因的克隆与生物信息学分析

时丕彪，胡凤琴，顾小兵，吕远大

（1.盐城市新洋农业试验站，江苏盐城224049；2.中国科学院南京土壤研究所，江苏南京210008 3.江苏省农业科学院种质资源与生物技术研究所，江苏南京210014；）

Rab蛋白是一类小分子量三磷酸鸟苷（guanosine triphosphate,GTP）结合蛋白，主要参与细胞器间的膜转运，将货物蛋白通过囊泡运输到目的地[1]。GTP结合蛋白在GTP与之结合时被激活，在GTP水解为GDP过程中失活，因此这类蛋白在这些过程中起着分子开关的作用[2-3]。Rab基因家族是植物重要的一类超大基因家族。研究表明，Rab家族不仅与植物的生长发育密切相关，而且在逆境胁迫和抗病方面也发挥着重要的作用[4]。目前，在拟南芥中已发现57个Rab蛋白，并将其分为8个亚家族：RabA～H[5]。T-DNA插入突变体试验表明，AtRabD2b和AtRabD2c在拟南芥花粉发育和花粉管生长方面起着重要的作用，并且它们在功能上是冗余的[6]。烟草中过量表达NtRab2基因会抑制花粉管的生长[7]。而将御谷PgRab7基因转入烟草中能显著增强烟草对干旱胁迫和盐胁迫的耐受性，说明PgRab7基因可能参与了植物胁迫响应[8]。在转基因水稻中过表达OsRab11基因，发现通过影响茉莉酸代谢途径相关基因的表达，增强了植株对病原菌的抗性[9]。TaRab7基因在小麦与条锈菌互作早期和抗逆性中起着重要的作用[10]。PtRabE1b的过量表达增强了杨树的耐盐性[11]。

玉米为世界上重要的粮食作物之一，关于Rab基因在玉米中的研究较少。因此，本研究克隆了玉米ZmRab6A基因并对其序列进行测定，分析了其编码蛋白的理化性质、保守结构域、二级结构、三级结构及与其他物种的亲缘关系等特征，为下一步研究其分子生物学功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料

玉米材料为笔者所在课题组保存的玉米自交系B73。取健壮幼苗的叶片组织，液氮速冻后保存在-80℃冰箱用于RNA提取。

1.2 玉米总RNA提取及cDNA合成

按照天根生化科技（北京）有限公司的RNAprep Pure植物总RNA提取试剂盒说明书提取玉米叶片总RNA。按照美国Thermo Scientific公司的Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒说明书合成cDNA第1条链，作为PCR扩增的模板。

1.3 玉米ZmRab6A基因的克隆

根据GeneBank登录的ZmRab6A基因序列，设计1对基因特异性引物，正向引物F：5'-CCCTGGT CTGTGGCCTCTGCGCTCC-3'，反向引物R：5'-TTATTTCGAAACAAAAGACCCGGTGT GATTC-3'，进行PCR扩增。扩增体系总体积50μL，其中2×Taq Master Mix 25μL，cDNA模板1μL，正反向引物各1μL，ddH2O 22μL。PCR反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35个循环；72℃延伸5 min。PCR产物胶回收后连接到pMD18-T载体，然后转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中。菌液PCR验证为阳性单菌落的菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

1.4 ZmRab6A基因的生物信息学分析

利用ORF finder在线分析ZmRab6A基因的开放阅读框架并翻译成氨基酸，利用Ex PASy Prot Param预测ZmRab6A编码蛋白的相对分子量和理论等电点，分别使用在线软件GORⅣ和SWISS-MODEL预测蛋白的二级结构和三级结构，用国家生物技术信息中心的保守结构域数据库NCBI CDD分析蛋白的保守结构域，Prot Scale在线预测蛋白的亲疏水性，分别利用SignalP-5.0和TMHMM Server v.2.0分析信号肽和跨膜区域的有无，采用蛋白质亚细胞定位预测工具PSORT预测亚细胞定位。使用MEGA 5.05软件，采用邻接法（Neighbor-Joining，NJ）（自展值bootstrap=1 000）构建系统进化树。

2 结果与分析

2.1 ZmRab6A基因的克隆

利用特异性引物进行RT-PCR扩增，从玉米叶片中克隆得到ZmRab6A基因1 044 bp的cDNA全长序列（图1）。序列分析表明，该基因含有1个660 bp的开放阅读框，编码219个氨基酸；5'非翻译区长155 bp，3'非翻译区长229 bp（图2）。在DNA水平上，ZmRab6A基因含有6个外显子和5个内含子，全长2 650 bp。

2.2 ZmRab6A的理化性质分析

利用ExPASy ProtParam分析ZmRab6A蛋白的理化性质，结果表明：其分子式为C1076H1726N288O338S9，相对分子量为24.39 ku，理论等电点为5.58；带负电荷残基（Asp+Glu）28个，带正电荷残基（Arg+Lys）26个；不稳定指数和脂肪族指数分别为46.68和86.76，推测ZmRab6A为不稳定蛋白。

2.3 ZmRab6A蛋白的亲/疏水性分析

利用ProtScale预测ZmRab6A蛋白的亲水性/疏水性，结果如图3所示，该蛋白的N末端有一个很强的疏水性结构，第128位和129位异亮氨酸（Ile）疏水性最强，分值为2.344；C末端有一个很强的亲水性结构，第209位丝氨酸（Ser）亲水性最强，分值为-2.600。该蛋白的总平均亲水性值为-0.173，推测其可能是亲水蛋白。

2.4 ZmRab6A的跨膜区域和信号肽预测

利用TMHMMServer v.2.0预测ZmRab6A蛋白的跨膜区域，结果显示，该蛋白没有跨膜螺旋区，属于非跨膜蛋白质（图4）。使用SignalP-5.0预测ZmRab6A信号肽的可能性，其值为0.004，因此该蛋白没有信号肽，属于非分泌蛋白（图5）。

2.5 ZmRab6A蛋白的保守结构域分析

结构域预测结果表明，ZmRab6A具有Rab蛋白典型的G结构域（G1、G2、G3、G4和G5），具有Rab6特异性位点，含有GTP/Mg2+结合位点，Rab蛋白特征序列RabF1、RabF2、RabF3、RabF4和RabF5，Rab亚家族序列RabSF1、RabSF2、RabSF3和RabSF4，开关Ⅰ、Ⅱ区域，同时还包含GEF互作位点、GDI互作位点和效应器互作位点，属于P-loop_NTPase超家族。

2.6 ZmRab6A蛋白的亚细胞定位预测

PSORT预测结果表明，ZmRab6A主要定位于细胞质膜（45%），其次是叶绿体类囊体膜（28%）、叶绿体基质（20%）和叶绿体类囊体空间（20%）。因此，推测ZmRab6A可能是一种胞质蛋白。

2.7 ZmRab6A蛋白的二级结构和三级结构预测

二级结构预测结果表明，ZmRab6A蛋白主要由α-螺旋、无规卷曲和延伸链构成，其中无规卷曲占比最大，为39.73%；其次是α-螺旋，占比37.90%；延伸链占22.37%（图6-A）。三级结构预测结果表明，ZmRab6A蛋白的空间结构主要是无规卷曲和α-螺旋，含有少量延伸链，与二级结构预测结果一致（图6-B）。

2.8 系统进化关系分析

基于NCBI的nr（non-redundant protein）蛋白数据库，利用BLASTP程序，比对得到其他物种Rab蛋白的氨基酸序列。序列比对结果表明，ZmRab6A蛋白与高粱（Sorghum bicolor，XP_002461043.1）的一致性最高，达94%；其次是狗尾草（Setaria viridis，XP_034580146.1）和谷子（Setaria italica，XP_022679 790.1），均达92%；与菠萝（Ananas comosus，XP_020 104318.1）、藜麦（Chenopodium quinoa，XP_02176572 6.1）、牵牛（Ipomoea nil，XP_019177322.1）、罂粟（Papaver somniferum，XP_026401556.1）、美花烟草（Nicotiana sylvestris，XP_009766624.1） 和 番 茄（Solanum lycopersicum，XP_004229706.1）的一致性分别为87%、86%、86%、85%、85%和85%；与亚麻芥（Camelina sativa，XP_010437115.1）、大 叶 藻（Zostera marina，KMZ76111.1）和 一 串 红（Salvia splendens，TEY33177.1）的一致性分别为76%、76%和75%；与狭叶羽扇豆（Lupinus angustifolius，XP_019416581.1）和 野 生 大 豆（Glycine soja，KHN31372.1）的一致性均为67%。以上均表现出较高的同源性。

系统进化树分析结果显示，玉米与同属禾本科的高粱、狗尾草和谷子的Rab6A蛋白处于同一分支，亲缘关系最近；与一串红、亚麻芥和大叶藻的Rab6A亲缘关系较远，与豆科植物野生大豆和狭叶羽扇豆的亲缘关系最远（图7）。

3 讨论与结论

Rab GTP结合蛋白作为囊泡转运的重要蛋白，参与了囊泡从供体细胞器出芽、与靶膜对接、拴系和融合的整个转运过程[12-13]。Rab家族在酵母、哺乳动物和高等植物中具有高度的保守性[14]，为生物有机体囊泡转运提供了一致的基础。目前，拟南芥Rab蛋白家族已被鉴定和详细分析。每个Rab成员约有200个氨基酸，并且序列具有高度相似性。所有Rab蛋白均具有5个典型的保守结构域，包括4个鸟嘌呤核苷酸结合结构域（G1、G3、G4和G5）与1个效应器结合结构域（G2）[3,15]。其中，G1是磷酸或Mg2+的结合位点，G4和G5是参与GTP-GDP结合和水解的关键位点。Rab在植物生长发育以及响应生物胁迫和非生物胁迫过程中发挥着重要的作用。例如，Rab蛋白影响着花粉管的生长[7]、叶片形态[16]、木质部发育[17]、自噬[18]、盐分胁迫[19]和病原菌防御[16]等。小分子量GTP结合蛋白Rab6主要是调控囊泡从高尔基体到内质网的逆向运输[20]。研究表明，AtRab6A与拟南芥根系发育密切相关[21]；OsRab6A参与调控水稻生长、粮食产量和铁元素的积累以响应大气中升高的CO2浓度[22]。

本研究以玉米ZmRab6A基因为研究对象，利用RT-PCR技术成功克隆了该基因的cDNA全长序列，并在DNA水平上分析了其基因结构。采用各种生物信息学软件对其编码蛋白ZmRab6A的理化性质、亲/疏水性、保守结构域和二级结构等进行分析，结果表明，ZmRab6A基因cDNA全长1 044 bp，含有1个660 bp的开放阅读框，编码219个氨基酸；在DNA水平上，ZmRab6A基因含有6个外显子和5个内含子，全长2 650 bp；ZmRab6A蛋白二级结构多为无规卷曲和α-螺旋，是一种无跨膜区域和信号肽的不稳定亲水性胞质蛋白，具有G结构域和Rab6特异性位点，属于P-loop_NTPase超家族蛋白。系统进化关系分析表明，玉米ZmRab6A与高粱、狗尾草和谷子中的亲缘关系最近，这与植物分类地位一致。以上研究为后续探讨ZmRab6A的生物学功能奠定了基础。