口腔扁平苔藓患者血清脂肪因子趋化素水平与Th17/Treg比值的相关性

郭明，郭盼，辛越红，黎炜

口腔扁平苔藓(oral lichen planus，OLP)是一种临床常见且好发于口腔黏膜的非感染性炎性疾病，其反复发作、可慢性迁延至终身，对患者身心健康造成严重影响[1]。但OLP发病原因及机制尚不完全清楚。脂肪因子趋化素(Chemerin)是脂肪细胞因子之一，与慢性肾脏病、溃疡性结肠炎、慢性胰腺炎、子痫前期等炎性反应相关疾病密切相关[2]。多囊卵巢综合征患者血清中Chemerin水平明显上调，经二甲双胍治疗后，其水平明显下降，其对多囊卵巢综合征具有一定诊断价值[3]。辅助性T细胞17(Th17)/调节性T细胞(Treg)比例失调可能影响各种免疫失调的炎性疾病发生发展[4]。Th17/Treg比值在OLP患者外周血中升高，其失衡在OLP发病进程中发挥重要作用[5]。但Chemerin在OLP患者血清中的表达情况及与Th17/Treg平衡的关系尚未见相关报道。现分析Chemerin在OLP患者血清中的表达水平及其与Th17/Treg平衡的关系，以期为临床诊治OLP提供依据，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2018年7月—2020年3月中国中医科学院西苑医院口腔科收治的OLP患者58例作为OLP组，其中男18例，女40例，年龄29～68(46.24±14.87)岁；体质量指数(BMI)17.56～24.35(20.97±2.87)kg/m2；病程1～15(7.46±5.83)个月；病变分型：非糜烂型33例，糜烂型25例。纳入同期医院健康体检者62例作为健康对照组：男21例，女41例，年龄31～66(45.91±14.72)岁；BMI 17.42～25.02(21.16±2.93)kg/m2。2组性别、年龄、BMI等比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准，入选者及家属知情同意并签署知情同意书。

1.2 病例选择标准 (1)诊断标准：参考《口腔黏膜病学》有关OLP判定标准进行诊断[6]。(2)纳入标准：①所有患者临床表现均符合OLP诊断标准，必要时进行病理确诊；②所有患者不伴有牙周炎、皮损、复发性阿弗他溃疡等其他口腔疾病；③患者自愿参与并完成该项研究。(3)排除标准：①口服药物、金属全冠、银汞合金等引起的苔藓样反应者；②合并糖尿病、高血压等全身系统疾病者；③合并艾滋病、乙肝、结核等感染性疾病者；④合并类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮及其他自身免疫性疾病者；⑤处于妊娠期、月经期、哺乳期女性；⑥近期使用过抗生素、糖皮质激素、免疫抑制剂者。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 样本采集：采集所有受试者清晨空腹肘静脉血7～8 ml，均分成2份。一份置于无菌EP管中，室温自然凝集30 min， 离心取上层血清，分装于冻存管中，于-80℃冰箱中保存备测；另一份置于含肝素抗凝剂的抗凝管备用。

1.3.2 血清Chemerin测定：上述血清采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测Chemerin水平，严格按照试剂盒(上海恒斐生物科技有限公司生产)说明书进行。

1.3.3 外周血Th17、Treg细胞测定：上述血液采用密度梯度离心法及Ficoll淋巴细胞分离液(北京百奥莱博科技有限公司生产)获得外周血单个核细胞，利用RPMI-1640培养液将外周血单个核细胞密度调整为2×106个/ml，利用流式细胞仪(型号 CytoFLEX，贝克曼库尔特商贸中国有限公司生产)检测Th17、Treg细胞含量，计算Th17/Treg比值。

1.3.4 血清IL-17、IL-10 mRNA测定：将保存的血清样本解冻，无菌环境下，直接采用TRIzol试剂盒(上海彩佑实业有限公司生产)、反转录试剂盒Reverse Transcription Kit(广州昂飞生物科技有限公司生产)提取总RNA并反转录成cDNA。参照SYBR Green QPCR mix荧光定量PCR试剂盒(上海经科化学科技有限公司生产)说明书配制反应体系，利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)基因扩增仪(型号 T20，杭州朗基科学仪器有限公司生产)进行cDNA扩增，qPCR检测。IL-17、IL-10均以β-actin为内参，引物由北京百奥莱博科技有限公司合成，其相应引物序列见表1。总反应体系(20 μl)包括：cDNA 3 μl，正向、反向引物各1 μl，SYBR Green QPCR mix 8 μl，DEPC水7 μl。反应步骤：95 ℃ 3 min，95 ℃ 20 s、65 ℃ 30 s、70 ℃ 18 s，35个循环；每个样品重复3次。采用2-△△CT法计算血清IL-17、IL-10相对表达量。

表1 IL-17、IL-10及内参β-actin的引物序列

2 结 果

2.1 2组血清Chemerin和外周血细胞Th17、Treg、Th17/Treg水平比较 与健康对照组比较，OLP组患者血清Chemerin水平和外周血Th17细胞百分比、Treg细胞百分比、Th17/Treg细胞比例均明显升高(P均<0.05)， 见表2。

表2 2组受试者血清Chemerin和外周血Th17、Treg及Th17/Treg水平比较

2.2 2组血清IL-17、IL-10 mRNA表达比较 与健康对照组比较，OLP组患者血清IL-17、IL-10 mRNA表达水平均明显升高(P均<0.05)，见表3。

表3 2组受试者血清IL-17 mRNA、IL-10 mRNA表达水平比较

2.3 血清Chemerin与Th17、Treg、Th17/Treg及IL-17 mRNA、IL-10 mRNA的关系 Pearson法分析显示，OLP患者血清中Chemerin水平与Th17、Treg、Th17/Treg及IL-17、IL-10 mRNA均呈正相关(r/P=0.461/0.000、0.456/0.000、0.411/0.000、0.477/0.000、0.459/0.000)。

3 讨 论

OLP是一种免疫介导的炎性疾病，具有恶变潜能，极可能危及患者生命安全[7-9]。因此，寻找OLP发病相关因素，对尽早诊治OLP具有重要意义。

Chemerin是一种趋化因子，在血液及多种组织中均有表达，其可在氧化应激、信号传导、免疫应答、炎性反应等生物学过程中起重要作用[10-11]。Chemerin在慢性肾脏病患儿血清中呈高表达，其表达水平与肾脏功能障碍有关，有望成为评估心血管疾病并发症及肾移植后肾结局的生物学指标[12]。Chemerin在溃疡性结肠炎中表达失调，其可能参与并影响溃疡性结肠炎疾病的发生发展，可能是治疗溃疡性结肠炎的潜在靶标[13]。Chemerin在慢性胰腺炎中水平上调，其可能在慢性胰腺炎发展进程中发挥重要作用，有可能是诊断慢性胰腺炎的潜在指标[14]。以上研究表明，表达异常的Chemerin与炎性疾病发展过程关系密切。本研究中OLP患者血清Chemerin水平明显高于健康体检者，提示其可能在OLP发病进展中起一定作用。分析其原因，Chemerin可能通过调控免疫细胞聚集，促进炎性反应，进而在OLP发展中发挥促炎作用，但仍需深入探究其作用机制。Th17/Treg平衡可有效维持机体免疫稳态，Th17/Treg失衡参与并影响自身免疫性疾病及过敏性疾病等炎性疾病的发展进程，Th17/Treg比值在过敏性哮喘患者外周血中明显升高，Th17/Treg失衡可能在过敏性哮喘中发挥重要免疫调节作用[15]。贾沛茹等[5]研究发现，Th17/Treg比例在OLP患者外周血中均增加，体内发生Th17/Treg平衡紊乱，与病情严重程度相关，调节Th17/Treg平衡，有望为治疗OLP提供新靶点。本研究显示，OLP组患者外周血Th17细胞百分比、Treg细胞百分比、Th17/Treg细胞比值均明显高于健康对照组，提示Th17及Treg细胞亚群均参与了OLP的全身免疫反应，且以Th17细胞占优势的Th17/Treg失衡可能在OLP发病过程中发挥免疫调节作用，具体机制有待进一步研究证实。

IL-17是由Th17细胞分泌的标志性促炎因子，可诱导趋化因子和其他细胞因子表达，从而介导炎性细胞聚集、浸润及组织损伤[16]。本研究显示，IL-17在OLP患者血清中呈高表达，与王婷婷等[17]研究趋势一致，提示IL-17可能参与并影响OLP发病过程。分析可能原因，Th17细胞可能被抗原呈递细胞激活后，释放IL-17，进而参与OLP的炎性反应过程。IL-10是由Treg等细胞分泌的抑制炎性因子，其可抑制促炎因子的释放及抗原的提呈，可在免疫炎性类疾病中发挥抑制炎性反应及免疫调节作用，IL-10在OLP外周血中表达上调，其可能在OLP发展进程中起重要作用。本研究中OLP组IL-10表达水平明显高于健康对照组，与徐建英等[18]研究趋势相符，提示Treg可能通过分泌IL-10，进而在OLP发生进展中发挥免疫调节作用。IL-10表达水平升高可能是机体全身免疫对局部炎性反应的免疫应激反应；此外，机体通过增加IL-10表达，使巨噬细胞的活化、自身反应性淋巴细胞的激活剂扩增受到抑制，从而维持免疫耐受[19]。

本研究显示，OLP患者血清中Chemerin水平与Th17、Treg、Th17/Treg及IL-17、IL-10 mRNA均呈正相关，提示Chemerin与Th17、Treg、Th17/Treg、IL-17 mRNA、IL-10 mRNA相互影响，从而在OLP发病过程中起一定作用，究其原因，Chemerin可能通过炎性介质分泌及表达的改变，从而促进OLP炎性反应过程，且Th17、Treg可能通过抗原刺激分别分泌IL-17、IL-10，从而在OLP疾病发展进程中发挥作用。进一步研究显示，OLP患者血清Chemerin水平与Th17/Treg细胞比例呈正相关，提示Chemerin的改变可能协同Th17、Treg细胞亚群失衡共同参与OLP发病进展。

综上所述，OLP患者血清Chemerin表达上调，且外周血Th17、Treg细胞百分比均升高，Th17/Treg平衡失调，Chemerin水平与Th17/Treg存在正相关性，Chemerin、Th17/Treg可能通过相互影响，进而在OLP发生发展中发挥作用。对Chemerin水平及Th17/Treg平衡的深入探究，有望为治疗OLP提供新靶点。但本研究仍有不足之处，研究样本量较少，可能会造成试验结果发生一定偏差，后续将扩大研究样本量，进行深入探究。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

郭明：设计研究方案，实施研究过程，论文撰写；郭盼：提出研究思路，分析试验数据，论文审核；辛越红：实施研究过程，资料搜集整理，论文修改；黎炜：提出研究思路，进行统计学分析