肝细胞肝癌中Piwil2表达与临床病理特征及预后的关系

王申涛，叶冬雪，陈云庆，李 宏，时维平，周 璇，项锋钢,

肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是多因素引起的消化系统恶性肿瘤，病死率高[1]。近年虽对HCC的诊疗取得一定的进展，但多数患者发现时已处于中晚期，预后较差，且对其癌变与侵袭的分子机制尚不清楚。因此，探索HCC侵袭、转移及预后的临床标志物具有重要的现实意义。Piwil2属于Argonaute蛋白家族PIWI亚家族成员[2]。Argonaute蛋白是RNA诱导沉默复合物(RISC)的主要部件，在RNA沉默、干细胞的繁殖更新及转录调控中均发挥重要作用[3]。有研究证实Piwil2在甲状腺癌、结肠癌、子宫颈癌、肺癌等多种癌症和癌细胞系中表达异常，且其表达与肿瘤转移复发均有关联[4]。但是尚未见其在HCC中的表达及与患者预后的相关性报道。本文采用免疫组化PV 6000法检测Piwil2在HCC组织及对应癌旁非瘤组织中的表达，分析其表达与HCC临床病理特征的关系及对患者预后的影响，探讨Piwil2表达在HCC发生发展、侵袭转移和预后中的意义。

1 材料与方法

1.1 材料收集2015年8月～2016年10月青岛大学附属医院存档的手术切除并经病理证实的HCC标本163例，包括HCC组织及对应癌旁非瘤组织(距癌组织≥5 cm，镜下排除HCC及瘤变)。入组HCC病例临床病理资料均完整，且术前均未实施其他方案治疗。其中男性135例，女性28例；年龄32～83岁，中位年龄57.6岁；HCC依据Edmondson标准进行分级：Ⅰ+Ⅱ级88例，Ⅲ+Ⅳ级75例；有包膜侵犯91例，无包膜侵犯72例；有脉管侵犯69例，无脉管侵犯94例；TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期138例，Ⅲ+Ⅳ期25例；HBsAg阳性128例，阴性35例。所有患者术后随访3年以上，目前持续随访中，以电话随访为主，患者复诊为辅。随访过程中163例HCC患者有26例失访，有完整随访信息者137例。本实验获得青岛大学附属医院伦理委员会批准，所有患者均知情同意。

1.2 试剂兔抗人多克隆抗体Piwil2购自美国Proteintech公司；通用型免疫组化PV 6000检测试剂盒购于北京中杉金桥公司；组织芯片由上海芯超公司制作并提供技术支持。

1.3 方法

1.3.1设计与制备组织芯片 将符合入选标准的HCC组织及对应癌旁非瘤组织蜡块行HE染色，采用双盲法由经验丰富的病理科医师对石蜡标本(包括HCC组织及对应癌旁非瘤组织)中有代表性的部位进行标记。根据收集的标本例数(每例患者两个组织芯，包括HCC组织和癌旁非瘤组织)设计为5个组织阵列，用细针打孔(直径1.5 mm)，将供体蜡块中标记好的组织芯取出并整齐排列到受体蜡块上，制成组织芯片蜡块。置于55 ℃温箱中10 min，待阵列融合完全后取出，4 μm厚连续切片，冷水漂片，45 ℃温水中展片2 min，捞片，拷片备用。将制备好的组织芯片进行HE染色，复检以确认芯片质量。

1.3.2免疫组化 将制备好的组织芯片行免疫组化PV 6000法染色，Piwil2抗体工作浓度为1 ∶50。先将切片脱蜡和水化，抗原修复，添加一、二抗，DAB显色，复染，中性树胶封固。具体操作步骤严格按抗体和试剂盒说明书进行，用试剂盒附带的已知阳性切片作为阳性对照，用PBS液代替一抗作为阴性对照。

1.4 结果判断Piwil2蛋白表达主要定位于细胞质，未着色为阴性，淡黄色为弱阳性，棕黄色为中度阳性，棕褐色为强阳性。显微镜下每个组织芯中随机选取5个高倍视野(400×)，每个视野计数100个癌细胞，取平均数。按阳性细胞百分率计分：阳性细胞数≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，≥76%为4分。按细胞染色强度计分：阴性为0分，弱阳性为1分，中度阳性为2分，强阳性为3分。将两项评分标准所得分值相加所得总分进行结果判定：0～3分为低表达，4～7分为高表达。

1.5 统计学分析所有数据应用SPSS 23.0软件进行统计学分析，计数资料采用χ2检验；用Kaplan-Meier曲线评估Piwil2表达与生存期的关系，并进行Log-rank检验。总生存期定义为手术日期与患者死亡日期之间的间隔；无瘤生存期定义为手术日期和复发日期之间的间隔。使用Cox比例风险模型评估Piwil2表达和HCC各临床病理变量的风险比和95%CI，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HCC及癌旁非瘤组织中Piwil2的表达163例HCC组织中Piwil2低表达85例(52.15%)，高表达78例(47.85%)；Piwil2在对应的癌旁非瘤组织中均呈低表达，149例(91.41%)为阴性，14例(8.59%)为弱阳性(图1～4)。Piwil2在HCC组织中的表达显著高于癌旁非瘤组织(χ2=102.532，P<0.001，表1)。

①②③④

表1 肝细胞肝癌组织和癌旁非瘤组织中Piwil2的表达[n(%)]

2.2 HCC中Piwil2表达与临床病理特征的关系Piwil2表达与肿瘤病理分级、TNM分期、包膜侵犯、脉管侵犯有关(P均<0.05)。TNM分期Ⅲ+Ⅳ期患者的高表达率为68%，高于Ⅰ+Ⅱ期(44.2%)(P=0.028)；病理分级Ⅲ+Ⅳ级高表达率为73.33%，高于Ⅰ+Ⅱ级(26.14%)(P<0.001)。有包膜侵犯、有脉管侵犯患者的高表达率也高于无包膜和脉管侵犯者(54.95%vs38.89%，P=0.042；63.77%vs36.17%，P<0.001)；Piwil2表达与患者年龄、性别、肿瘤直径、HBsAg无关(P均>0.05，表2)。

表2 肝细胞肝癌中Pwil2表达与临床病理特征的关系[n(%)]

2.3 Piwil2表达与HCC患者预后的关系本组患者有26例失访，将有完整随访信息的137例患者进行Kaplan-Meier预后生存分析，结果显示，Piwil2高表达组患者的总生存期(P<0.001，图5A)和无瘤生存期(P<0.001，图5B)较低表达组短。Piwil2高表达组和低表达组的总生存时间分别为(31.74±1.90)个月和(42.14±0.43)个月；无瘤生存时间分别为(26.67±2.25)个月和(40.63±0.52)个月。另外，TNM分期Ⅲ+Ⅳ期患者Piwil2高表达组总生存时间(P=0.004，图5C)和无瘤生存时间(P=0.010，图5D)比低表达组短；病理分级Ⅲ+Ⅳ级患者Piwil2高表达组总生存时间(P=0.018，图5E)和无瘤生存时间(P=0.001，图5F)比低表达组缩短。

发生包膜侵犯和脉管侵犯者Piwil2高表达组总生存时间(P=0.003，图5G)和无瘤生存时间(P=0.001，图5H)亦比低表达组短。

图5 Piwil2表达与肝细胞肝癌患者生存期的关系：A.总生存期；B.无瘤生存期；C.TNM Ⅲ+Ⅳ期患者总生存期；D.TNM Ⅲ+Ⅳ期患者无瘤生存期；E.病理分级Ⅲ+Ⅳ级患者总生存期；F.病理分级Ⅲ+Ⅳ级患者无瘤生存期；G.有包膜和脉管侵犯患者总生存期；H.有包膜和脉管侵犯患者无瘤生存期

2.4 HCC患者预后的Cox单因素和多因素分析将各临床因素进行Cox单因素回归分析发现，HBsAg(P=0.035)、肿瘤直径(P=0.030)、病理分级(P=0.002)、TNM分期(P=0.001)、包膜侵犯(P=0.015)、脉管侵犯(P=0.008)、Piwil2表达(P<0.001)是影响患者术后总生存期的危险因素；TNM分期(P<0.001)、脉管侵犯(P=0.020)、Piwil2表达(P<0.001)是影响患者术后无瘤生存期的危险因素。Cox多因素回归分析发现，TNM分期(P=0.007)、Piwil2表达(P<0.001)是影响HCC患者术后总生存期的独立风险因素；同时TNM分期(P=0.005)、Piwil2表达(P<0.001)也是术后无瘤生存期的独立风险因素(表3、4)。

表3 单因素和多因素Cox回归分析肝细胞肝癌患者术后总生存期的影响因素

表4 单因素和多因素Cox回归分析肝细胞肝癌患者术后无瘤生存期的影响因素

3 讨论

HCC在我国的发生率较高，占原发性肝癌组织学类型的90%，且晚期患者占比较高。近年HCC的诊断与治疗虽取得进展，但由于其高恶性程度、高转移率、高复发率，患者预后仍不能令人满意[5]。Piwi蛋白首先在果蝇的生殖细胞中被人们发现。Piwil2属于Piwi蛋白的一个亚型，有PAZ和Piwi两个保守的结构域，在生殖细胞的维持中发挥作用，且在癌症干细胞中显著表达[6]，并可通过RNA干扰和miRNA对目标mRNA的降解作用参与染色质修饰和抑制相关基因的表达，在肿瘤进程中发挥癌基因的作用，还可促进肿瘤细胞的细胞周期和增殖，通过调节参与细胞生长、代谢、凋亡和致癌作用的众多基因的表达来促进恶性转化和癌症进展[7-8]。已有研究证明Piwil2在多种肿瘤组织中表达异常[4]，且其表达与肿瘤的发生发展、侵袭转移、复发预后密切相关。但是Piwil2在HCC中的表达情况研究较少，尚未见Piwil2表达与HCC临床病理特征及预后之间的研究报道。

Wang等[9]发现Piwil2在癌旁非瘤组织、结肠腺瘤、结肠癌中的阳性率呈上升趋势。Feng等[10]研究发现Piwil2在子宫颈癌组织中的阳性率明显高于正常子宫颈上皮组织，并且证实Piwil2在诱导体细胞恶性转化中起重要作用。本实验采用组织芯片技术和免疫组化法检测163例HCC组织和对应癌旁非瘤组织中Piwil2的表达，发现Piwil2在HCC组织中的表达水平明显高于癌旁非瘤组织，提示Piwil2可能参与早期HCC的恶性转化过程。Sarvestani等[11]发现Piwil2在乳腺癌中高表达，且其表达与肿瘤浸润深度、TNM分期、病理分级和淋巴结转移有关。Yang等[12]的研究发现在前列腺癌中Piwil2高表达，敲低PC-3细胞中Piwil2的表达，显著降低了PC-3细胞的侵袭和转移能力。本组实验发现异常表达的Piwil2主要定位于细胞质，在分化程度低、TNM分期晚的患者中Piwil2表达增高；有包膜侵犯和脉管侵犯的患者中Piwil2表达水平高于无侵犯者。提示Piwil2高表达促进肿瘤细胞的增殖与浸润，参与HCC的侵袭和转移过程。

有研究发现Piwil2表达与多种肿瘤预后相关，Piwil2高表达是神经胶质瘤[13]和膀胱尿路上皮癌[14]患者预后不良的重要决定因素，但是Li等[15]在胰腺癌中的研究发现Piwil2高表达患者的总体生存期较长，其高表达反而提示患者预后良好。由此可见，Piwil2对不同类型癌症患者预后的影响存在差异。本组Kaplan-Meier生存分析显示，Piwil2高表达HCC患者的总生存时间和无瘤生存时间比低表达者短，提示Piwil2高表达预示患者预后不良。此外，本组还对病理分级Ⅲ+Ⅳ级、TNM分期Ⅲ+Ⅳ期、有包膜侵犯和脉管侵犯的患者进行了生存分析，发现Piwil2高表达患者的总生存时间和无瘤生存时间均短于低表达患者。进一步提示Piwil2表达是影响HCC患者预后的重要因素。邓鑫[16]研究发现Piwil2高表达可激活PI3K/AKT通路，促进癌细胞增殖；还可激活TGF-β/Smad通路，促进肿瘤侵袭转移，这或许导致了HCC患者术后的高复发与较差的预后。通过Cox回归模型分析发现，Piwil2表达、TNM分期是影响HCC患者术后总生存期和无瘤生存期的独立影响因素。以上结果表明，Piwil2与HCC患者预后显著相关，其高表达提示患者预后不良。因此检测其表达对HCC患者的诊疗有重要临床意义。

综上所述，本实验发现Piwil2在HCC中的表达明显增高，表明Piwil2与HCC的发生、发展有一定关联；其表达与临床病理特征和患者预后之间的关系，表明其在HCC的侵袭、转移机制中发挥作用并可能由此影响患者预后。在以后的工作中，作者将采用细胞系及荷瘤动物继续深入探讨Piwil2在HCC发生、发展中的具体作用机制，为HCC的临床治疗和预后判断提供新指标。