类NADC30 猪繁殖与呼吸综合征病毒FJZ03 株感染性克隆的构建及鉴定

勾明郗，林志锋，邓小莺，黄晓紫，毛 婉，徐 叶，李 娜，杨小燕，魏春华*，刘建奎*

（1.龙岩学院生命科学学院，福建 龙岩 364000；2.福建省家畜传染病防治与生物技术重点实验室，福建 龙岩 364000；3.福建农林大学动物科技学院，福建 福州 350002）

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由PRRS 病毒（PRRSV）引起的以母猪严重的繁殖障碍和仔猪呼吸道症状为主要特征的病毒性传染病，给世界养猪业造成了严重的经济损失[1-4]。根据其抗原性和病毒基因组的差异，将PRRSV 分为2 个基因型：Type 1 PRRSV（欧洲型，EU）和Type 2 PRRSV（北美型，NA），两者之间的核苷酸同源性仅为50%～70%[1]。

2006 年国内暴发的高致病性PRRS（HP-PRRS）给中国的养猪业造成了重大的经济损失[2]。2012 年我国出现了引起妊娠母猪严重流产和仔猪呼吸系统疾病的新流行株，该类病毒与美国NADC30 病毒高度同源，因此称之为类NADC30 株（NADC30-like PRRSV），与经典株VR2332 相比，该类病毒在NSP2区均存在3 段不连续的131 个氨基酸缺失（aa322～aa432、aa483 和aa504～aa522），与HP-PRRSV NSP2区存在不连续的30 个氨基酸（aa481 和aa533～561）的缺失模式不同[2-6]。序列分析表明，类NADC30 株的Nsp2、ORF5及全基因组与国内HP-PRRSV 及VR2332的同源性分别为63.7%～74.5%，82.4%～92.2%和83.4～85.9%，基于Nsp2、ORF5 和全基因组遗传进化分析表明类NADC30 株与国内HP-PRRSV 处于不同的进化分支，这些数据表明国内出现的类NADC30 株是不同于HP-PRRSV 新的变异病毒[3-5]。

基于Type 2 PRRSV 的全球流行病毒株的分类系统，我国的流行株分为4 个谱系：lineage 1、lineage 3、lineage 5.1 和lineage 8.7，处于lineage 8.7 的HPPRRSV 和lineage 1 的类NADC30 株是我国流行的优势流行株[5,7-8]。目前，类NADC30 株至少在全国18 个省份流行，引起流产风暴（怀孕母猪流产率为30%～50%），可能已经成为PRRSV 的主要流行株[9,12]。此外，该类病毒显著的特点是易与其他病毒株发生重组，重组后的病毒之间毒力差异较大，导致现有的商品化疫苗不能对其提供有效的免疫保护，给我国的生猪养殖带来新的挑战[9-12]。反向遗传操作技术的广泛应用，为PRRSV 致病性决定因子的研究提供了有效的途径[13-15]。基于此，本研究通过反向遗传操作技术构建中等毒力的类NADC30 PRRSV FJZ03 株的感染性克隆，并拯救重组病毒，以期为深入研究该类病毒的致病机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 病毒和细胞NADC30-like FJZ03株（KP860909）于2013 年分离自福建省某暴发PRRS 的规模化猪场。Marc-145 细胞由龙岩学院生命科学学院重点实验室保存。猪肺泡巨噬细胞（PAMs）从4 周龄PRRSV、PCV2 均为阴性的仔猪肺泡灌洗液中获得。

1.2 主要试剂反转录酶Superscript III reverse tran⁃scriptase、Platinum®pfx DNA polymerase 和Lipofectamine LTX and PlUS Reagents 均 购 自Thermo Fisher Sci⁃entific 公司；质粒提取试剂盒购自OMEGA 公司；限制性内切酶和T4 DNA 连接酶购自NEB 公司；pBlue⁃script II SK（+）载体购自Fermentas 公司；RNA 提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；FITC 标记山羊抗小鼠IgG 购自碧云天生物技术有限公司；pEASY-Blunt Cloning Kit 载体购自北京全式金生物技术有限公司；PRRSV N 蛋白单克隆抗体（MAb）由福建省家畜传染病防治与生物技术重点实验室制备并保存。

1.3 引物设计与合成根据FJZ03 株全基因组（KP860909）序列，利用Oligo 7.0 软件设计6 对引物，用于分段扩增该病毒的全基因组（表1）。利用引物EF/ER 将FJZ03 基因组中的A14378G 突变产生一个新的Mlu I 酶切位点，作为鉴定拯救病毒的遗传标记。引物均由北京睿博兴科生物技术有限公司合成。

表1 扩增NADC30-like PRRSV 全基因组的引物信息Table 1 Primers used for NADC30-like PRRSV

1.4 载体改造及病毒全基因组的扩增首先在pBluescript II SK（+）载体多克隆位点（MCS）的上游插入CMV 启动子，下游插入丁型肝炎病毒核酶。其次通过对PRRSV FJZ03 株全基因组序列的酶切位点分析，对pBluescript II SK（+）载体的MCS 进行改造，以Xho I-Sph I-Sca I-Not I-Nru I-Mlu I-Xba I 序列替换pBluescript II SK（+）中Xho I～Xba I 的序列，便于后续全长cDNA 克隆的构建，改造后的重组质粒经测序鉴定正确后命名为pSK。

按照试剂盒说明书提取FJZ03 株病毒RNA，利用设计的扩增各片段的下游引物将其分别反转录为cDNA，以其为模板，利用表1 中的各引物分别PCR扩增PRRSV 全基因组各片段。将纯化后的各目的片段A～F 经酶切后分别连接至pSK 载体中，构建中间质粒pSK-A～pSK-F。经PCR 和酶切鉴定各中间质粒，阳性质粒由北京睿博兴科生物技术有限公司测序鉴定。

1.5 全长cDNA 克隆的构建将重组质粒pSK-B 和pSK-C 分别经Sac I/Not I 双酶切，回收相应片段连接至pSK 中，得到重组质粒pSK-BC。用相同方法分别依次连接A 片段和D 片段，得到重组质粒pSKBCAD。将重组质pSK-E 和pSK-F 分别经Mlu I/Xba I酶切后连接至pSK 中构建重组质粒pSK-EF。将质粒pSK-BCAD 和pSK-EF 分别经Nru I/Xba I 酶切后连接至pSK-BCAD 中构建包含全长cDNA 的质粒pSKAF，经PCR 和酶切鉴定后的阳性克隆由北京睿博兴科生物技术有限公司测序鉴定，正确的克隆命名为pSK-FJZ03。

1.6 病毒的拯救及鉴定按Lipofectamine LTX and PLUSTMReagents 说明书将全长cDNA 克隆pSK-FJZ03转染至生长良好的Marc-145 细胞，96 h 后收获细胞培养液（P1 代），反复冻融3 次， 离心后取上清接种至Marc-145 细胞连续传代。传到第3 代时出现了明显的CPE，收获病毒液提取RNA，利用含有分子标记的Marker-F/Marker-R 引物进行RT-PCR 扩增，将回收纯化的PCR 产物连接到pEASY-Blunt Cloning Kit载体，经Mlu I 酶切鉴定后由北京睿博公司测序鉴定分子标记。同时将P3 代拯救病毒接种24 孔培养板中的Marc-145 细胞（每孔放1 张细胞爬片），培养48 h 后用4%多聚甲醛固定，PBS 洗涤后以PRRSV N蛋白MAb（1∶800）为一抗，以FITC 标记的山羊抗小鼠IgG（1∶1 600）为二抗孵育1 h，PBS 洗涤后以中性树脂封片，经激光共聚焦鉴定。鉴定正确的重组病毒命名为RvFJZ03。

1.7 拯救病毒RvFJZ03 生长曲线的测定将亲本病毒FJZ03 与拯救病毒RvFJZ03 按MOI 0.1 分别接种Marc-145 细胞和原代PAMs 细胞，分别于感染后12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h 和84 h 收获细胞培养液，按照Reed-Muench 法计算病毒的TCID50，并根据不同时间点病毒的滴度绘制病毒的生长曲线。

1.8 拯救病毒的遗传稳定性试验将拯救病毒RvFJZ03（P3 代）在Marc-145 细胞中连续传20 代，提取每代次病毒液RNA，利用Marker-F/Marker-R 进行RT-PCR 扩增，PCR 产物均经Mlu I 酶切和测序鉴定；按照Reed-Muench 法分别计算第2 代、4 代、8代、12 代、16 代和20 代拯救病毒RvFJZ03 的病毒滴度。

2 结果与讨论

2.1 NADC30-like FJZ03 株全长cDNA 质粒的构建与鉴定结果提取FJZ03 株病毒RNA，反转录合成cDNA 后，分别经PCR 扩增获得了该株病毒全基因组的6 个片段，分别为3 000 bp、3 500 bp、3 440 bp、4 900 bp、2 850 bp 和710 bp，均与预期大小相符（图略）。将这6 个片段分别连接到pSK 载体，构建含该株病毒全长cDNA 的质粒pSK-AF，全长约为18.6 kb。测序结果表明正确构建了PRRSV FJZ03 全长cDNA 质粒，将其命名为pSK-FJZ03。

本研究采用CMV 真核启动子，将FJZ03 株基因组全长cDNA 置于启动子下游，构建了能够在动物细胞体内转录的cDNA 全长克隆，利用宿主细胞的转录酶系统转录出病毒全基因组RNA，并翻译出PRRSV 所需的蛋白完成组装，从而获得拯救病毒，操作简单、快速，省去了cDNA 克隆质粒的线性化、纯化和体外转录等繁琐的步骤[16]。为了获得真实的cDNA 序列，本研究利用耐热Superscipt IV re⁃verse transcriptase 逆转录酶，提高了逆转化效率。采用的高保真PCR 酶具有3'-5'校验功能，从而降低了PCR 过程中可能出现的碱基错配，保证了基因序列的忠实性。

2.2 重组病毒的拯救及鉴定结果将pSK-FJZ03 转染Marc-145 细胞后，每天观察细胞是否出现CPE，96 h 后收获细胞上清液（P1 代）反复冻融后，继续传代。结果传至第3 代（P3）可观察到典型的CPE，而对照细胞正常。收获P3 代的病毒液提取RNA 后，反转录为cDNA，利用Marker-F/Marker-R 经PCR 扩增，对PCR 产物经Mlu I 酶切鉴定。结果显示，P3 代的PCR产物出现490 bp 和220 bp两个条带，而亲本病毒FJZ03 仅有一条带（图1A），测序结果也显示Mlu I酶切位点（ACGCGT）存在于拯救病毒中（图1B）。表明，获得了携带Mlu I 位点的拯救病毒RvFJZ03。

采用激光共聚焦试验鉴定P3 代的拯救病毒。结果显示拯救病毒感染的Marc-145 细胞呈现特异性绿色荧光，未感染的对照细胞则无特异性绿色荧光（图2）。进一步表明拯救了重组病毒RvFJZ03，且其能够在Marc-145 细胞中增殖。

2.3 拯救病毒的遗传稳定性测定结果将拯救病毒RvFJZ03（P3 代）在Marc-145 细胞连续传代，测定第2代、4代、8代、12代、16代和20代病毒的滴度，并采用1.6 的方法鉴定Mlu I 遗传标记。结果显示，接种各代次病毒的细胞均出现了CPE，且各代次的RvFJZ03 效价介于105.5TCID50/mL～107.0TCID50/mL；酶切和测序鉴定结果显示，遗传标记Mlu I 存在于每代拯救病毒中，且未发生变异。表明拯救病毒RvFJZ0 能够稳定传代，且Mlu I 位点能够稳定存在。

图1 拯救病毒PCR 产物的Mlu I 酶切（A）和测序（B）鉴定结果Fig. 1 Identification of the rescued virus by Mlu I digestion and sequence analysis

图2 拯救病毒RvFJZ03 的激光共聚焦鉴定结果Fig. 2 Identification of the rescued virus RvFJZ03 by laser confocal

2.4 拯救病毒的生生长动力学测定结果拯救病毒RvFJZ03 和亲本病毒FJZ03 的多步生长曲线测定结果显示，拯救病毒RvFJZ03 在Marc-145 细胞和PAMs细胞中的生长曲线均与亲本病毒FJZ03 相似，无明显差异（图3）。表明拯救病毒RvFJZ03 的生长特性与亲本病毒FJZ03 株相一致，这为利用该拯救病毒研究该类病毒致病的分子机制奠定基础。

图3 拯救病毒RvFJZ03 在Marc-145 细胞(A)和原代PAMs 细胞(B)中的生长曲线Fig.3 Growth kinetics of rescued and parental virus in Marc-145 cells(A)and PAMs(B)

本研究团队前期研究结果表明，类NADC30 株对仔猪的致病性与NADC30 相似但低于HP-PRRSV，属于中等毒力的病毒[12,17]。此外，本研究团队证实商品化的PRRS 减毒活疫苗不能对FJZ03 株感染的仔猪产生良好的免疫保护作用[12]。目前，人们对类NADC30 株的致病机理、病毒毒力变异等问题尚不十分清楚，反向遗传技术为PRRSV 的致病分子机制研究提供了非常有效的途径。因此，本研究构建带有遗传标记Mlu I 酶切位点的类NADC30 FJZ03 株的感染性cDNA 克隆，拯救出与亲本病毒增殖特性相似的重组病毒，且其可以稳定传代，这为进一步研究该类病毒的致病机制奠定基础。