猪源产肠毒素大肠杆菌菌毛基因多重PCR 检测方法的建立及初步应用

刘国梅，李 培，左玉柱，李杰峰，张 宁，刘曼迪，刘迎迎，李 妍*

（1.河北农业大学动物医学院，河北 保定 071001；2.河北省畜牧兽医研究所，河北 保定 071000）

大肠埃希氏菌病属于国家三类传染病，其中产肠毒素大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）在临床上可引起仔猪、犊牛、羔羊以及其他经济动物的水样腹泻，也可引起发展中国家的婴儿腹泻和发达国家的旅游者腹泻[1]。ETEC 感染对新生仔猪和断奶仔猪的危害最为严重，可引起仔猪白痢、黄痢以及水肿病。临床症状表现为呕吐、腹泻、排黄白色水样稀粪、消瘦脱水，并伴随其他疾病的继发感染甚至死亡，对养猪业造成了重大的经济损失[2]。

ETEC 菌毛类型众多，其中K88（F4）、K99（F5）、987P（F6）、F18 和F41 在我国乃至全世界流行较广[3]。菌毛也被称为黏附素，可通过结合动物小肠绒毛的特异性受体，帮助菌体定植于宿主肠道，继而释放多种肠道毒素，引起宿主水和电解质失衡，导致腹泻[4]。菌毛具有免疫原性和抗原性，为ETEC 疫苗研发的主要靶标。由于ETEC 菌毛类型众多且多为混合感染，患病动物携带菌毛种类不明确，给疾病防治带来严峻考验[5]。在我国南方地区发现F18 为ETEC 的优势菌毛，F18ab 与F18ac 两种亚型菌毛的流行状况差异很大[6-7]。而河北省缺少对该病的流行病学调查，多采用K88/K99/987p 三联疫苗预防，效果不佳，极大影响了对该病的防控。因此准确鉴定病畜所携带的ETEC 菌毛类型，有助于更好的研究其流行状况，为疫苗的研发提供重要参考依据。

ETEC 菌毛类型的传统鉴定方法包括细菌分离、革兰氏染色镜检及生化培养等，过程复杂且灵敏度不高。由于PCR 技术具有快速、准确、特异性强及试验成本低等特点，常用于疾病的快速诊断。国内外有检测3、4 和5 种ETEC 菌毛基因的多重PCR 方法，均是针对K88、K99、F18、987p 和F41菌毛基因，缺乏同时对F18ab 和F18ac 菌毛分型鉴定的研究[8-10]。基于此，本研究将建立一种可同时鉴定ETEC 中携带K88、K99、F18ab、F18ac 及F41 5 种菌毛类型的多重PCR 方法，并对河北省腹泻仔猪进行ETEC 菌毛基因的鉴定，为ETEC 菌毛类型的鉴别检测提供技术手段，为仔猪腹泻的防控提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 菌株及主要试剂分别携带K88、 K99、F18ab、F18ac 和F4 菌毛的5 株标准猪源ETEC、猪源霍乱沙门氏菌和猪源链球菌均购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心。大肠杆菌DH5α 和2×Taq PCR MasterMix 购自天根生化科技（北京）有限公司。101 株大肠杆菌分离自河北省石家庄、沧州、保定、张家口及衡水地区10 个养殖场患腹泻的仔猪脏器。其中，43 株来源于石家庄、沧州和张家口地区养殖场猪的肝脏样品；31 株来源于石家庄、张家口和衡水地区养殖场猪的肺脏样品；18 株来源于保定和石家庄地区养殖场猪的肾脏样品；9 株来源于沧州和保定地区养殖场猪的脾脏样品。伊红美兰、麦康凯和营养琼脂培养基均购自北京奥博星生物技术有限公司；革兰氏染色液购自康华生物技术有限公司；酵母浸出物、胰蛋白胨购自英国OXOID 公司；氯化钠购自福晨（天津）化学试剂有限公司；DL1500 DNA Marker 购自北京康为世纪科技有限公司；琼脂糖购自西班牙BIOWESTE 公司。

1.2 多重PCR 引物的设计与合成根据GenBank登录的大肠杆菌基因组序列，利用Primer Premier5软件和NCBI 线上Primer-BLAST 功能（https://www.nc⁃bi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）设计引物。分别针对大肠杆菌uidA 基因，ETEC 菌毛基因K88、K99、F18ab、F18ac 和F41 保守区域设计特异性引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物序列见表1。

表1 PCR 引物信息Table 1 PCR Primers used in this study

1.3 细菌基因组DNA 的提取采用煮沸法提取携带5 种菌毛基因的猪源ETEC 基因组DNA。通过核酸蛋白检测仪检测OD260nm确定DNA 浓度。根据Gen⁃Bank 中登录的大肠杆菌基因组大小，计算基因组DNA 的拷贝数。

1.4uidA基因的PCR 扩增以提取的1 株标准猪源大肠杆菌基因组DNA 为模板，并以猪源霍乱沙门氏菌基因组DNA 及灭菌水作为对照，采用uidA-F/uidA-R PCR 扩增细菌的uidA 基因，用以鉴定大肠杆菌。PCR 反应程序：94 ℃3 min；94 ℃30 s、60 ℃30 s、72 ℃1 min，30 个循环；72 ℃5 min，4 ℃保存。PCR 产物通过1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.5 菌毛基因的单一PCR 扩增以1.3 提取的5 种标准ETEC DNA 为模板，使用表1 中的引物分别对其K88、K99、F18ab、F18ac和F41菌毛基因进行PCR扩增。PCR 反应体系为25 μL：上下游引物各2 μL，终浓度 为3.2 μmol/L；DNA 模板1 μL，终浓 度为5.7×106拷 贝/μL；2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL；ddH2O 补至25 μL。反应程 序：94 ℃3 min；94 ℃30 s、57 ℃30 s、72 ℃1 min，30 个 循 环；72 ℃5 min，4 ℃保存。PCR 产物通过1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.6 菌毛基因的多重PCR 扩增及优化将表1 中的各菌毛基因上下游引物均稀释至20 μmol/L，并且等比例混合，各DNA 模板稀释至1.4×108拷贝/μL 等比例混合备用。以5种标准菌株的DNA为模板，分别对引物终浓度（1.6 μmol/L～6.4 μmol/L）、DNA 混合模板终浓度（4 ng/μL～32 ng/μL，3.5×106拷贝/μL～2.5×107拷贝/μL）和退火温度（55 ℃～62 ℃）进行优化。PCR反应体系为25 μL：混合引物4 μL，混合模板1 μL，2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，ddH2O 补至25 μL。反应程序：94 ℃3 min；94 ℃30 s、55 ℃～62 ℃30 s、72 ℃1 min，30 个循环；72 ℃5 min，4 ℃保存。PCR产物通过1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.7 多重PCR 的特异性试验以分别携带K88、K99、F18ab、F18ac、F41菌毛基因的标准ETEC、5株标准菌株混合基因组DNA，提取的大肠杆菌DH5α、猪源霍乱沙门氏菌和猪源链球菌的基因组DNA 为模板，按照优化后的多重PCR 扩增，检测该方法的特异性。

1.8 多重PCR 的敏感性试验10 倍倍比稀释携带各菌毛基因的猪源ETEC混合DNA模板，使模板浓度为2.5×107拷贝/μL～2.5×103拷贝/μL，按照优化后的多重PCR 扩增，检测该方法的敏感性。

1.9 临床样品的检测采用煮沸法提取临床样品分离的101 株大肠杆菌的基因组DNA，以其为模板，采用uidA 基因的PCR 扩增，进一步鉴定分离的大肠杆菌，随机选取PCR 产物测序。以上述猪大肠杆菌DNA 作为模板，采用本研究建立的多重PCR 方法检测101 株大肠杆菌的菌毛基因类型。实验重复两次，并统计河北省猪大肠杆菌菌毛基因类型的流行情况。根据1.5 所述试验方法，使用表1 中的引物对这101 株大肠杆菌5 种菌毛基因类型进行单一PCR鉴定，比较两种PCR 方法的检测结果，并计算二者的阳性符合率。

2 结 果

2.1 大肠杆菌uidA基因的PCR扩增结果使用表1所列的uidA 基因引物对1 株标准大肠杆菌基因组DNA进行PCR扩增。结果显示，猪源大肠杆菌基因组DNA PCR 扩增结果为阳性，长度约为647 bp，与预期相符，而猪源霍乱沙门氏菌的基因组无扩增（图1）。表明该PCR 方法特异性较强，可用于鉴别大肠杆菌属。

图1 大肠杆菌uidA 基因的PCR 扩增结果Fig. 1 PCR amplification of E. coli uidA gene

2.2 菌毛基因的单一PCR扩增结果使用表1中的引物分别对5 种携带不同菌毛基因的标准ETEC 基因组DNA 进行单一PCR 扩增。结果显示，5 种标准菌株基因组DNA 均扩增出了目的条带，且均与预期相符（菌毛基因K88、K99、F18ab、F18ac和F41产物长度分别为343 bp、157 bp、282 bp、494 bp 和580 bp）（图2）。表明，各引物均能有效扩增各大肠杆菌菌毛基因。

图2 各菌毛基因的单一PCR 扩增结果Fig. 2 Single PCR amplification result of each fimbriae gene

2.3 多重PCR 反应条件优化结果将5 种标准ETEC 基因组DNA 混合进行多重PCR 扩增，分别优化引物浓度、模板浓度和退火温度。结果显示，当反应体系中各菌毛基因的引物终浓度为3.2 μmol/L，DNA 模 板 终 浓 度 为2.5×107拷 贝/μL，退 火 温 度58 ℃。图3 结果显示，当退火温度为55 ℃、56 ℃和58 ℃时，5 条PCR 产物条带均比较清晰，且各产物大小均与预期相符，无非特异性扩增。为了避免在实际应用中出现非特异性条带干扰，选择较高的58 ℃作为退火温度。

2.4 多重PCR 的特异性试验结果分别以各标准ETEC 混合或者单独基因组DNA 为模板，利用优化的多重PCR 方法进行扩增。结果显示，多重PCR 可从携带K88、K99、F18ab、F18ac 和F41 菌毛的大肠杆菌混合或者单独基因组DNA 扩增出相应目的条带，但大肠杆菌DH5α、猪源霍乱沙门氏菌和猪源链球菌基因组DNA 无扩增（图4），表明该方法特异性较强。

图3 多重PCR 退火温度的优化结果Fig. 3 Optimization of multiplex PCR annealing temperature

图4 多重PCR 的特异性试验结果Fig. 4 Specificity tests of multiplex PCR

2.5 多重PCR 的敏感性试验结果以等量混合的携带5 种菌毛的ETEC 基因组DNA（2.5×107拷贝/μL～2.5×103拷贝/μL）为模板，采用本研究建立的多重PCR 方法扩增。结果显示，当5 种混合大肠杆菌基因组DNA 浓度为2.5×104拷贝/μL 时仍然可以有效扩增（图5）。因此，多重PCR 各菌株DNA 的最低检测量均为2.5×104拷贝/μL，表明该方法的敏感性较高。

2.6 临床样品的检测结果采用uidA 基因的PCR 方法检测101 株分离的大肠杆菌，结果表明均为大肠杆菌。随机选取的11 个PCR 产物的测序结果显示，均与大肠杆菌uidA 基因序列完全吻合，进一步说明了该鉴定结果的准确性。通过多重PCR 方法对101株大肠杆菌进行两次鉴定，结果显示河北省仔猪腹泻普遍存在携带多菌毛类型的ETEC（表2）。其中，携带K88、K99、F18ab 和F41 ETEC 的检出率最高为37.6%（38/101）；其 次，携 带K88、K99 和F18ab ETEC 的检出率为19.8%（20/101）；携带K88、F18ab和F18ac ETEC 的检出率为16.8%（17/101）；而携带5种菌毛K88、K99、F18ab、F18ac 和F41 ETEC 的检出率为9.9%（10/101）；携带其它类型菌毛ETEC 的检出率均在10%以下。因此，河北省仔猪腹泻绝大多数为携带3 种及3 种以上菌毛的ETEC 混合感染，未发现单一菌毛感染。对分离菌进行的5 种菌毛的单一PCR 结果与多重PCR 检测结果一致，二者对5种菌毛检测结果的符合率为100%（表3）。表明多重PCR 方法准确性较高，可以用于临床样品的检测。

图5 多重PCR 的敏感性检测结果Fig. 5 Sensitivity detection of multiplex PCR

表2 多重PCR 对临床样品的检测结果Table 2 Detection of clinical samples by multiplex PCR

表3 两种方法对临床样品检测结果的符合率Table 3 The coincidence rate of the two methods in testing the clinical samples

3 讨 论

临床上引发仔猪腹泻的病原种类很多，其中ETEC 是造成仔猪断奶后腹泻（PWD）的主要病原[11]。由于ETEC 菌毛类型较多，在临床上多为各菌毛大肠杆菌的混合感染，因此准确鉴定腹泻仔猪所携带的ETEC 菌毛类型可为该病的防治提供依据[12]。单一PCR 方法鉴定多种菌毛过程繁琐，费时费力。本实验设计的多重PCR 方法能够快速鉴定大肠杆菌以及ETEC 的菌毛类型，为疾病诊断和流行病学调查提供了有效手段。

由于仔猪腹泻病常伴随多种病原混合感染，因此鉴定病原是否为大肠杆菌是首要步骤[13]。本研究根据国内外学者建立的大肠杆菌PCR 鉴定方法，通过比较并筛选后，选择uidA 基因作为鉴定大肠杆菌的特异性基因，其特异性高于16S rDNA 基因的PCR方法[14-15]。本研究针对各大肠杆菌携带的菌毛基因保守区域设计了引物，通过BLAST 排除了引物与基因组其他序列之间的非特异性结合，通过序列分析还排除了引物形成二聚体的可能。为了提高该多重PCR 方法的检测效率，本实验对该PCR 方法进行了一系列优化。包括退火温度、引物浓度和模板浓度的优化，当退火温度为58 ℃，引物终浓度为3.2 μmol/L，混合模板终浓度为2.5×107拷贝/μL 时，该多重PCR 扩增效果最佳。特异性检测结果显示，该多重PCR 可鉴定携带多个菌毛基因的ETEC，但未能扩增其他致病菌及大肠杆菌DH5α，表明引物特异性较强。多重PCR 的敏感性结果显示，该方法对每种ETEC 基因组DNA 的最低检测量均为2.5×104拷贝/μL，敏感性较高。近年来，国内外报道的多种ETEC 多重PCR 鉴定方法均不能对其F18ab 和F18ac菌毛进行分型鉴别[8-9]。可鉴定F18ab 和F18ac 菌毛的双重PCR 方法又未能覆盖ETEC 的其他菌毛类型[7]。因此，本研究建立的多重PCR 方法完善了目前的检测技术，提高了检测效率。

为了评估该多重PCR 方法的准确性及可行性，本研究对分离的101 株大肠杆菌进行了两次该多重PCR 的检测，以及一次单一PCR 验证，结果完全一致，表明该多重PCR 方法可靠，可用于临床检测。从流行病学调查结果来看，河北地区大多数仔猪腹泻是由携带3 种及3 种以上菌毛ETEC 的混合感染所致。F18ab 在河北省ETEC 中的检出率最高，达到了99.0%，而F18ac 的检出率仅有34.6%。K88 和K99 的阳性率分别为89.1%和82.1%，F41的阳性率为50.4%。近几年，有多项研究对我国各地区ETEC 菌毛类型的流行情况进行了报道。例如，广西地区ETEC 的菌毛类型以F41 和K88 为主[16]；河北承德地区K88 和F18 菌毛类型在临床分离的大肠杆菌中检出率均为25%左右[17]；在上海临港地区240 份猪的样品中分离得到3 株ETEC，均为F18ac 菌毛[6]。上述结果充分表明了我国各地区ETEC 的优势菌毛类型有所不同。综上所述，本研究建立的多重PCR 方法可用于快速鉴定腹泻仔猪所携带的ETEC 菌毛类型，适用于大批量样本的检测，特异性强，灵敏度高。为ETEC 菌毛的鉴别检测和其感染的流行病学调查提供了技术手段。