羊源尸毒梭菌三重PCR 检测方法的建立及应用

豆朋朋，王 利*，魏 勇

（1.西南民族大学青藏高原动物遗传资源保护与利用教育部和四川省重点实验室，四川 成都 610041；2.四川省畜牧科学研究院，四川 成都 610041）

尸毒梭菌（Clostridium cadaveris）属于芽孢杆菌科，梭菌属。该菌广泛分布于土壤、海底沉积物和人的粪便中，为孢子卵圆、端生的革兰氏阳性杆菌[1]。尸毒梭菌与危害人和动物健康的3 大致病性梭菌（破伤风梭菌、肉毒梭菌、产气荚膜梭菌）同为梭菌属，尸毒梭菌可以导致人和动物创伤感染、脓肿、菌血症等[2]。我国是养羊大国，目前仅见一篇从羊体分离出致病性尸毒梭菌的报道，该研究采用16S rDNA 基因的PCR 扩增方法对羊源尸毒梭菌进行了鉴定[2]。目前，还没有羊源尸毒梭菌快速检测的报道，因此快速检测该菌对于该菌感染的防治意义重大。23S rRNA 基因为尸毒梭菌的特异性基因。HPI 毒力岛携带有与致病性和毒力相关的基因，可能在各种细菌间存在着水平转移。irp2 基因编码与铁摄取有关的铁调节蛋白，而铁元素是保证细菌在宿主体内存活的关键因素，因此携带有irp2 的菌株可摄取铁元素，易在宿主体内存活，具有较强的毒力，因此该基因是检测HPI 毒力岛的靶标[3-4]。目前，尚无梭菌属细菌检测到HPI 毒力岛的报道。溶血素（Hemolysin，hlyA）是公认的毒力因子，它作为成孔细胞溶血素家族成员之一，可以在宿主细胞膜上形成孔道从而对宿主细胞起到杀伤作用；hlyA 编码溶血素前体、可以激活宿主体内的胰蛋白酶、具有广谱的杀细胞作用，对大部分哺乳动物细胞（如红细胞、单核细胞等）具有细胞溶解和细胞毒性作用[5-7]。基于此，本研究基于尸毒梭菌23S rRNA 基因、irp2 基因和hlyA 基因设计引物，建立致病性尸毒梭菌三重PCR 的快速检测方法，为防治和检测致病性尸毒梭菌引起的细菌性疾病提供技术手段。

1 材料与方法

1.1 菌株及实验动物尸毒梭菌（Clostridium cadav⁃eris）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）、类志贺邻单胞菌（Plesimonas shigelloides）、乳酸片球菌（Pediococ⁃cus acidilactici）、藤黄微球菌（Micrococcus luteus）、霍氏肠杆菌（Enterobacter hormaechei）、阴沟肠杆菌（En⁃terobacter cloacae）、大肠杆菌（Escherichia coli）、柠檬酸杆菌（Citrobacter amalonaticus）、枯草芽孢杆菌（Ba⁃cillus subtilis）保存于西南民族大学青藏高原动物遗传资源保护与利用教育部和四川省重点实验室。20只健康、体质量相近的SPF BALB/c 小鼠购自四川省成都市中医药研究所。

1.2 主要试剂1.1×T3 Super PCR MIX、4S Red Plus Nucleic Acid Stain、细菌基因组DNA 提取试剂盒均购自天根生化科技（北京）有限公司；DL2000 Marker购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.3 引物设计根据GenBank 中尸毒梭菌23S rRNA基因、HPI 毒力岛irp2 基因和溶血素hlyA 基因序列，经分析比对后利用Primer 6.0 软件设计3 对特异性引物，引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物信息见表1。

1.4 单一PCR 反应体系的建立利用组织/细菌DNA 提取试剂盒提取尸毒梭菌DNA，利用岛津紫外分光光度计测定其浓度后，以其为模板，利用23S rRNA 基因、irp2 基因和hlyA 基因引物分别经单一PCR扩增后测序。各基因单一PCR 总体系均为25 μL，含1.1×T3 Super PCR Mix 22 μL，尸毒梭菌DNA 模板1 μL，各基因上下游引物各1 μL。PCR 反应条件：98 ℃2 min；98 ℃10 s、（51 ℃～64 ℃）15 s、72 ℃30 s，共35 个循环；72 ℃2 min。PCR 产物回收纯化后由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

表1 三重PCR 引物Table 1 Primers used for the triple PCR

1.5 三重PCR 检测方法的优化及建立根据1.4 建立的单一PCR 扩增条件，对三重PCR 方法的退火温度（55 ℃～61 ℃）、引物对比例（1∶1∶1、1∶2∶1、1∶2∶2 等）、引物浓度（5 μmol/L～30 μmol/L）进行优化。按照优化后的反应条件进行三重PCR 扩增，PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.6 特异性试验利用组织/细菌DNA 提取试剂盒提取1.1 所有菌株的DNA 作为模板，按照优化后的反应条件进行三重PCR 扩增，检测该方法的特异性。

1.7 敏感性试验将1.4 提取的已知浓度的尸毒梭菌DNA，用双蒸水10 倍倍比稀释（100～1010）后分别作为模板，按照优化后的反应条件进行三重PCR 扩增，检测该方法的敏感性。根据公式（6.02×1023拷贝数/moL）×（ng/μL×10-9）/（DNA 长度×660），计算尸毒梭菌DNA 的拷贝数。

1.8 重复性试验将尸毒梭菌的DNA 平均分为4 份每份做3 个重复，分别冻存1 d、7 d、14 d、21 d 后经该三重PCR 方法扩增；选择10 个不同稀释度的尸毒梭菌DNA（77.20 ng/μL～7.72×10-9ng/μL），每个稀释度设置3 个重复，经该三重PCR 扩增，检测该方法的重复性。

1.9 三重PCR 检测方法的应用将20 只SPF BALB/c 小鼠随机分为实验组和对照组，10 只/组。将实验组和对照组小鼠分别经腹腔注射0.2 mL 浓度为1.5×109cfu/mL 尸毒梭菌菌悬液和生理盐水，连续观察7 d。及时剖检死亡小鼠，采集其心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肠道共6 个组织，共采集10 只小鼠。利用组织DNA 提取试剂盒提取小鼠组织的基因组DNA 作为模板，利用本研究建立的尸毒梭菌三重PCR 方法扩增；并同时采用16S rDNA 通用引物（F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG/R：CTACG GCTACCTTGTTACGA）经PCR 扩增，PCR 产物由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。比较两种方法的检测结果，并计算二者的符合率。

2 结 果

2.1 单一PCR 扩增结果以尸毒梭菌DNA 为模板，采用3 种基因引物，分别经单一PCR 扩增。结果显示，分别得到长度约为500 bp、350 bp 和250 bp 的目的条带，且当退火温度为59 ℃时，3 种目的基因扩增条带最亮（图略）。测序后目的条带分别为106 bp、261 bp 和536 bp，均与预期（23S rRNA、hlyA、irp2 基因）大小一致。

2.2 三重PCR方法的优化结果经优化后的三重PCR最佳反应体系为：1.1×T3 Super PCR Mix 18 μL，DNA模板1 μL，3 对引物上、下游引物均为1 μL（终浓度为10 μmol/L），总体系为25 μL。最优反应条件为：98 ℃2 min；98 ℃10 s、59 ℃15 s、72 ℃30 s，共35 个循环；72 ℃2 min。退火温度的优化结果见图1，退火温度为59 ℃时，3 条目的条带最亮，因此选择59 ℃作为该三重PCR 方法的最佳退火温度。

图1 三重PCR 方法退火温度的优化结果Fig. 1 Triple PCR was amplified at different temperatures

2.3 三重PCR 特异性试验结果特异性试验结果显示，仅尸毒梭菌经三重PCR 扩增出现3 条目的条带，而蜡样芽孢杆菌、类志贺邻单胞菌、乳酸片球菌、藤黄微球菌、霍氏肠杆菌、阴沟肠杆菌、大肠杆菌、柠檬酸杆菌及枯草芽孢杆菌均未扩增出目的条带（图2）。表明建立的多重PCR 方法特异性较强。

2.4 三重PCR 敏感性试验结果经测定尸毒梭菌DNA浓度为77.20 ng/μL，经计算为2.76×1010拷贝/μL。将 其10 被 倍 比 稀 释 后（2.76×1010拷 贝/μL～2.76×100拷贝/μL）作为模板，经该三重PCR 方法扩增。结果显示，该方法对该菌DNA 的最低检出量为2.76×101拷贝/μL（图3）。表明，该方法的敏感性较高。

图2 三重PCR 方法的特异性试验结果Fig. 2 The specificity of triple PCR

图3 三重PCR 的敏感性检测结果Fig. 3 The sensitivity of triple PCR

2.5 三重PCR 重复性试验结果利用建立的三重PCR 方法分别对冻存1 d、7 d、14 d、21 d 的各4 份尸毒梭菌DNA 进行扩增，结果3 次重复试验结果一致。将10 份不同稀释度的尸毒梭菌DNA 进行的3 次重复性试验结果均为阳性（图略）。表明建立的三重PCR 方法重复性较好。

2.6 三重PCR 检测方法的应用感染1.5×109cfu/mL尸毒梭菌的小鼠12 h 后全部死亡，对照组小鼠未出现发病和死亡。采集死亡小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和肠道6 个组织，共60 份样品，利用组织DNA 提取试剂盒提取小鼠组织的基因组DNA，经三重PCR 扩增后结果显示，每只小鼠的肝脏、肾脏和肠道共30 份样品检测结果均为阳性，而心脏、肺脏和脾脏均为阴性结果。表明，该菌感染后主要分布在肝脏、肾脏和肠道中。采用16S rDNA的PCR 扩增这60 份小鼠组织样品，PCR 产物经测序比对后与三重PCR 方法结果一致。符合率为100%（表2）。两种方法具有一致性。表明建立的尸毒梭菌三重PCR 适合应用于临床样品的检测。

表2 两种检测方法对小鼠组织样品检测结果的比较Table 2 Comparison of two methods of tissue samples

3 讨 论

尸毒梭菌最早发现于免疫功能受损个体的胃肠道，Rajiv 等发现尸毒梭菌感染病例主要发生在免疫功能低下的宿主中[8]。Saam 等发现尸毒梭菌作为人类病原体的报道仅有5 次[9-11]。然而，由尸毒梭菌引起的腹腔内感染和菌血症等与人密切相关疾病的发病率却在升高[12]。对该菌的快速检测有助于诊断、预防和治疗该菌引起的相关疾病。本研究的小鼠感染试验中，小鼠腹腔注射尸毒梭菌12 h 后全部死亡，且在死亡小鼠的肝脏、肾脏、肠道均检测到了该菌，同时需要警惕该菌的致病性可能在增强。另外推断该菌可能对动物或者人类的肝脏、肾脏、肠道有一定的嗜性，为后续对该菌的致病性研究奠定了一定的基础。

目前仅有豆朋朋等用16S rDNA PCR 方法鉴定尸毒梭菌的报道，未见用其他方法鉴定和检测该菌的文献[2]。相较于单一PCR，多重PCR 方法具有高效性及特异性强等特点，在细菌的快速检测中具有重要的临床意义和广泛的应用前景。张昕杨等建立了肠出血性大肠杆菌（EHEC）O157 的多重PCR 检测方法，为动物养殖与肉品加工过程中EHEC O157 的检测提供了便捷、灵敏、可靠的技术手段[13]。本研究的一个难点就是可参考的文献太少，设计检测尸毒梭菌靶基因时更是耗费了很大的精力和物力，经过多次试验反复优化实验过程，最终建立了基于23S rRNA、hlyA、irp2 3 个基因的尸毒梭菌三重PCR 检测方法。该方法与16S rDNA PCR 方法对感染小鼠组织样品的检测结果一致，且该方法特异性强、灵敏度高、重复性好，可以较低成本在1 个多小时内完成检测，该三重PCR 方法的建立为尸毒梭菌的快速检测提供了便捷。