山羊IL-10 蛋白在金黄色葡萄球菌感染免疫反应中调节机制的研究

郑 姚，李 娟，王 利*，魏 勇

（1.西南民族大学青藏高原动物遗传资源保护与利用教育部和四川省重点实验室，四川 成都 610041；2.四川省畜牧科学研究院，四川 成都 610041）

白细胞介素10（Interleukin-10，IL-10）为同型二聚体蛋白质，其单链折叠结构域的内部核心有很强的疏水性，其结构和IL-19、IL-20、IL-22 等相似，均属于IL-10 超家族（Superfamily of interleukin-10-re⁃lated cytokines）[1-2]。IL-10 是 一 种 多 功 能 的 抗 炎 因子，主要介导机体炎症并诱导机体体液免疫应答，参与抗体生成，其次与其他炎症因子相互调节共同参与免疫反应，维持机体正常功能[3]。

金黄色葡萄球菌是一种常见的致病菌，可引起羊的葡萄球菌病，症状与损害部位有关，可诱发山羊出现局部化脓性感染、胃肠炎、肺炎等[4]。四川山羊皮下脓肿病例中金黄色葡萄球菌检出率达26.3%，仅次于伪结核棒状杆菌[5]。西藏扎布耶盐山羊的金黄色葡萄球菌检出率可达16.24%[6]。金黄色葡萄球菌感染症状大多表现为炎症，而IL-10 在机体肠炎、肝炎、胰腺炎等炎症疾病中具有重要作用[7-9]。目前关于IL-10 的免疫相关研究在新西兰白兔和猪中已有报道，多集中于对其特异性抗体的制备与应用[10-12]，山羊IL-10 相关研究尚未见报道。本研究初步探讨体外表达的山羊IL-10 蛋白在金黄色葡萄球菌感染免疫反应中的调节机制，以期为深入研究其在山羊免疫应答中的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料无特定病原体（SPF）级30日龄昆明（KM）雌性小鼠15 只（体质量20±2 g），购自成都达硕实验动物有限公司。金黄色葡萄球菌（1×108cfu/mL）补充质粒由西南民族大学青藏高原动物遗传资源保护与利用教育部和四川省重点实验室提供。RNAiso Plus、PrimeScriptTMRT Reagent Kit 和TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ，及pET-32a载体均购自宝生物工程（大连）有限公司；BCA 蛋白定量试剂盒购自天根生化（北京）有限公司；鼠抗His 标签单克隆抗体（MAb）和His 标签蛋白纯化试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司；山羊抗小鼠IgG-HRP和ECL发光试剂购自生工生物工程（上海）股份有限公司；总抗氧化能力（T-AOC）检测试剂盒（ABTS 法）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPX）测定试剂盒（比色法）和丙二醛（MDA）测定试剂盒（TBA 法）购自南京建成生物工程研究所。重组质粒pMD19T-IL-10 由本实验室制备[13]。

1.2 山羊IL-10 原核表达、纯化及western blot 鉴定经KpnⅠ/EcoRⅠ酶切重组质粒pMD19T-IL-10 获得山羊IL-10 基因片段，克隆至pET-32a 载体，经EcoRⅠ/MluⅠ双酶切鉴定以及测序分析，获得的阳性重组质粒即为pET32a-IL-10。将该重组质粒转化于E. coli BL21（DE3）感受态细胞，培养至OD600nm为0.4～0.6 时加入终浓度为1.5 mmol/L 的IPTG，28 ℃诱导12 h，参照文献[14]使用His 标签蛋白纯化试剂盒纯化并复性获得重组蛋白IL-10（rIL-10）。SDSPAGE 检测蛋白表达情况，并利用BCA 蛋白定量试剂盒纯化蛋白并测定浓度。以鼠抗His 标签MAb（1∶4 000）为一抗，山羊抗小鼠IgG-HRP（1∶10 000）为二抗，ECL 发光试剂显色，经western blot 分析。

1.3 金黄色葡萄球菌感染试验选取15 只30 日龄健康昆明雌性小鼠，饲养于相同环境。随机分为A、B 和C 组，每组5 只。B 组和C 组小鼠均经腹腔注射500 μL 金黄色葡萄球菌（1×108cfu/mL），A 组为对照组，注射相同剂量的生理盐水。感染24 h 后C组小鼠腹腔注射200 μg/kg rIL-10，感染48 h 后采集各组小鼠的血液，4 ℃静置后离心取血清保存于-20 ℃。同时迫杀各组小鼠，采集心、肝、脾、肺、肾和小肠等组织样品，于-80 ℃保存备用。

1.4 各组小鼠血清学指标检测利用T-AOC 检测试剂盒（ABTS 法）、GSH-PX 测定试剂盒（比色法）和MDA 测定试剂盒（TBA 法）分别测定1.3 中收集的各组小鼠血清中T-AOC、GSH-PX 活性和MDA 含量。

1.5 荧光定量PCR 检测各组小鼠炎症因子的转录水平参考文献[15]，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成TNF-α、IL-1β 和IL-2 基因的荧光定量PCR 引物。采用RNAiso Plus 试剂对1.3 采集的各组小鼠各组织样品充分研磨处理，根据RNAiso Plus试剂说明方法分别提取组织总RNA，然后利用Prime⁃ScriptTMRT Reagent Kit 合成cDNA。以GAPDH 为内参基因，采用荧光定量PCR 测定各组织中3 种炎症因子（TNF-α、IL-1β、IL-2）mRNA 的转录情况。反应程序：95 ℃3 min；95 ℃10 s、退火20 s、72 ℃30 s，39 个循环；熔解曲线阶段65 ℃5 s、95 ℃3 min。每个样品3 次重复。采用2-ΔΔCt法分析结果，通过SPSS24.0 单因素方差分析其显著性，p<0.05 表示差异显著，p<0.01 表示差异极显著。

2 结 果

2.1 山羊IL-10 原核表达重组质粒的构建与鉴定构建的重组质粒经EcoRⅠ/MluⅠ酶切鉴定，结果显示，获得约4 500 bp 和1 500 bp 的两条目的条带（图1），与预期相符。测序结果显示重组质粒中正确插入IL-10 基因序列。表明重组质粒pET32a-IL-10 正确构建。

图1 重组质粒pET32a-IL-10 酶切鉴定Fig. 1 Identification of recombinant plasmid pET32a-IL-10 by restriction enzyme digestion

2.2 山羊IL-10 蛋白原核表达与鉴定重组菌pET32a-IL-10/DE3 经IPTG 诱 导 后SDS-PAGE 检 测，结果显示出现约为27 ku 的目的重组蛋白条带，且目的蛋白主要以包涵体形式表达（图2A）。经纯化复性后，SDS-PAGE 显示在约27 ku 处有单一条带（图2B），表明得到了纯化的rIL-10。Western blot 鉴定结果显示出现特异性条带（图2C），进一步表明表达得到rIL-10。

图2 重组蛋白IL-10 的原核表达与鉴定Fig. 2 Prokaryotic expression and identification of recombinant protein IL-10

2.3 rIL-10 对各组小鼠血清学指标的影响利用T-AOC 检测试剂盒（ABTS 法）、GSH-PX 测定试剂盒（比色法）和MDA 测定试剂盒（TBA 法）分别测定各组小鼠血清T-AOC、GSH-PX 和MDA 含量，结果显示，B 组小鼠血清MDA 含量增加，极显著高于A 组（p<0.01），T-AOC 和GSH-PX 酶活性下降，极显著低于A 组（p<0.01）。C 组小鼠MDA 含量下降，极显著低于B 组（p<0.01），与A 组小鼠差异不显著。C 组小鼠T-AOC 增加，极显著高于B 组（p<0.01），与A组差异不显著，C 组小鼠GSH-PX 极显著高于A 组和B 组（p<0.01）（图3）。表明经金黄色葡萄球菌感染致使小鼠抗氧化能力减弱，机体受到了一定的损伤，但经rIL-10 处理后小鼠的机体损伤得到了一定的修复。

图3 rIL-10 对小鼠血清免疫指标的影响Fig. 3 Effects of rIL-10 on serum immune indicatorsof mice

2.4 rIL-10 对炎症因子转录水平的影响采用荧光定量PCR 检测小鼠3 种炎症因子在6 种组织中的转录水平，结果显示，IL-1β 基因转录水平在B 组小鼠心、肝、肺和肾组织中明显上升，极显著高于A组（p<0.01），在C 组小鼠心、肝、脾和肺中明显下降，极显著低于B组（p<0.01），C组小鼠IL-1β的基因转录水平在脾中极显著低于A 组（p<0.01），在肾中极显著高于A 组（p<0.01）。3 个组小鼠的IL-1β 基因转录水平在小肠中差异不显著（图4A）。

炎症因子IL-2 基因的转录水平在B 组小鼠肝、脾、肺和小肠组织中明显上升，显著或极显著高于A 组（p<0.05 或p<0.01），在心脏中表现出下降趋势，显著低于A 组（p<0.05），在肾中差异不显著。IL-2基因转录水平在C 组小鼠肝、脾、肺、肾和小肠中明显下降，显著或极显著低于B 组（p<0.05 或p<0.01），在心、脾和肾中显著低于A 组（p<0.05），在小肠中显著高于A 组（p<0.05）（图4B）。

TNF-α 基因转录水平在B 组小鼠的小肠中显著高于A 组（p<0.05）。TNF-α 基因转录水平在C 组小鼠心、脾、肺和小肠中显著或极显著低于B 组（p<0.05或p<0.01），在心、脾和肺中显著或极显著低于A 组（p<0.05或p<0.01），在肝和肾中差异不显著（图4C）。

以结果表明金黄色葡萄球菌导致小鼠各组织炎症因子转录水平普遍升高，而经山羊rIL-10 处理可降低炎症因子的转录水平。

图4 各组小鼠各组织炎症因子（TNF-α、IL-1β 和IL-2）转录水平的检测结果Fig. 4 The mRNA level of TNF-α, IL-1β and IL-2 in different murine tissues

3 讨 论

目前关于IL-10 蛋白的体外表达在鸡、猪、人和斜带石斑鱼等中已有报道[8,16-18]。如研究人员原核表达了21.0 ku 的猪rIL-10[8]和37.7 ku 的新西兰白兔rIL-10[9]；石继红等扩增获得530 bp 人外周血淋巴细胞IL-10，并将其与能够特异结合新生血管内皮细胞整合素的多肽序列RGD 融合表达，构建pETIL10-RGD 表达载体获得19.3 ku 大小的rIL-10，且以包涵体形式存在[17]。本研究获得了山羊rIL-10 也以包涵体形式表达，这与新西兰白兔rIL-10 表达形式相似。各物种IL-10 蛋白大小不同的可能原因：一方面是由于不同物种IL-10 基因序列的差异，另一方面是由于选用的原核表达载体和表达条件的不同所引起的差异。

IL-10 作为一种多功能抗炎因子参与机体的炎症反应，与免疫系统的调节密切相关。杨峰等研究发现金黄色葡萄球菌感染小鼠后诱导机体氧化应激，引起炎症反应[19]。Ouyang 等研究发现在小鼠体内IL-10 能抑制因炎症引起的组织破坏[20]。本研究发现山羊rIL-10 可通过下调小鼠血清MDA 含量，增加抗氧化能力而修复机体损伤。金黄色葡萄球菌感染小尾寒羊乳腺后，其血清中TNF-α 和IL-1β 的表达量升高[21]，本研究中感染小鼠的细胞因子表现出同样的趋势，表明在感染过程炎症细胞因子在金黄色葡萄球菌引起的炎症中发挥了一定的作用。有研究发现在患有关节炎的小鼠体内补充IL-10 能明显降低IL-1β 和TNF-α 等炎性细胞因子水平[22]。雷帕霉素、阿奇霉素等可促进金黄色葡萄球菌感染的小鼠体内IL-10 的表达增强，降低IL-2 水平，从而减轻失控性炎症反应[23-24]。本研究发现经rIL-10 处理后抑制了小鼠炎症损伤，进而减轻器官功能障碍的进一步发展。在正常机体中，炎症因子与抗炎因子之间处于一种平衡状态。IL-10 通过抑制促炎性细胞因子（IL-1β、IL-2 和TNF-α）的合成与分泌，有助于减轻炎症反应和减少组织损伤。

综上所述，本研究表达并纯化得到山羊rIL-10，研究发现山羊rIL-10 可调节小鼠血清MDA、T-AOC和GSH-PX 的转录水平，下调免疫炎症因子的转录水平，改善免疫因子紊乱，抑制小鼠因金黄色葡萄球菌引起的炎症反应。本研究为进一步探究IL-10 免疫调节机制提供实验数据，为山羊抗病机制研究奠定了基础。