直肠癌患者术后血清miR-204、miR-182水平与应激性溃疡出血发生的相关性

徐敏，王义增 ，潘立峰，康伟明

1 天津医科大学朱宪彝纪念医院、天津市内分泌研究所、国家卫健委激素与发育重点实验室、天津市代谢性疾病重点实验室，天津300134；2 天津医科大学总医院；3 石家庄市妇幼保健院

直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，近年来，直肠癌的发病率呈逐年增长的趋势，并且更趋向年轻化［1］。临床上多采取手术治疗，早期直肠癌患者术后5 年生存率可达90%以上，晚期术后生存率可能不足10%［2］，而目前大多数直肠癌患者被检出时已发展到中晚期。应激性溃疡出血（SUB）是直肠癌患者术后较为典型的并发症之一，主要临床表现为急性黏膜糜烂、溃疡，最后发展为出血、肠穿孔等，给患者生理、心理造成极大打击［3］。微小RNA（miR⁃NA）为一类长18～22 个核苷酸的内源性单链小非蛋白编码 RNA［4］，大量研究表明，miRNA 的靶基因调控作用发生在转录后，通过参与细胞增殖、分化、凋亡等生物学功能调控肿瘤的发展、迁移［5］。MO⁃HAMED等［6］研究发现，胃癌患者血清miR-204、miR-182 均呈高表达，且对胃癌有一定的诊断价值，但关于miR-204、miR-182 与直肠癌患者的相关性研究报道并不多见。因此，本研究通过探究直肠癌患者术后血清 miR-204、miR-182 水平与 SUB 发生的相关性，以期为临床诊治提供依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取 2016 年 6 月—2019 年 11 月天津医科大学朱宪彝纪念医院和天津医科大学总医院收治的直肠癌手术患者237 例为研究对象（观察组），所有患者经手术病理证实为直肠癌，其中男 129 例、女 108 例，年龄 26～74 岁。根据术后是否发生SUB 分为SUB 组（12 例）和非SUB 组（225例），SUB 的发生率为5.06%。满足以下其中一项即可判定为SUB：①呕吐物或胃抽取物肉眼可见鲜红色或咖啡色液体；②柏油样便、黑便或粪隐血试验呈阳性；③经镜检发现患者胃黏膜部位出现片状或点状血灶、溃烂或糜烂等［7］。排除标准：①合并恶性肿瘤；②传染性疾病；③近1 个月有消化道溃疡史；④合并血液系统疾病。同期选取20 例体检健康者作为对照组，其中男13 例、女7 例，年龄23～72 岁。对照组与观察组性别、年龄等一般资料比较，差异无统计学意义。所有研究对象知晓并自愿签署知情同意书。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2 研究方法

1.2.1 临床相关资料采集 由2 名专业医师统计并记录患者临床资料信息，包括患者年龄、性别、吸烟史、饮酒史、肝肾功能状况、术前合并心脑血管疾病情况、术后并发症等。

1.2.2 血清miR-204、miR-182 检测 主要试剂与仪器：TRIzol 试剂（北京柏莱斯特科技发展有限公司）；反转录试剂盒（上海研卉生物科技有限公司）；实时荧光定量PCR 试剂盒SYBR Premix Ex Taq（美国UNIBIOTEST 公司）；BY/TD-3A 型血型血清学多用离心机（北京海富达科技有限公司）；CFX384 Touch 型实时荧光定量PCR仪（美国伯乐公司）。所有患者入院24 h内采集静脉血4 mL，健康体检者采集晨起空腹外周血4 mL，4 ℃下2 000 r/min离心15 min，收集上层清液于干净EP 管中，-20 ℃保存待测。为防止反复冻融影响血清内容物水平，样品每隔一段时间统一检测。使用TRIzol试剂提取总RNA后，利用反转录试剂盒合成cDNA，所有操作按照说明书操作规范进行。以cDNA为模板，利用荧光定量PCR技术检测血清 miR-204、miR-182。 总 反 应 体 系 20 µL：SYBR Premix Ex Taq 9µL，上游引物1µL，下游引物1 µL，cDNA 2 µL，dH2O 7 µL。循环参数：95 ℃，预变性2 min；95 ℃，变性20 s；62 ℃，退火30 s，共40个循环。miR-204、miR-182均以U6为内参，引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。miR-204上游引物序列：5"-ACGCGGCTGGGAAGGCAAAG-3"、下游引物序列：5"-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3"，miR-182上游引物序列：5"-GGCTTTGGCAATGGTAGAAC-3"、下游引物序列：5"-GTGCGTGTCGTGGAGTCG-3"，U6上游引物序列：5"-GCTTCGGCAGCACATATATA-3"，下游引物序列：5"-CGCTTCACGAATTTGCGTGTGT-3"。用 2-ΔΔCt法计算血清 miR-204、miR-182 的相对表达量。

1.3 统计学方法 采用SPSS22.0 统计软件。计量资料以±s表示，两组间比较采用t检验；计数资料用例（%）表示，组间比较采用χ2检验；采用Pearson法分析直肠癌术后发生SUB 患者血清miR-204 与miR-182 水平的相关性；利用Logistic 回归分析影响直肠癌患者术后发生SUB 的危险因素。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组血清miR-204、miR-182 水平比较 观察组血清miR-204、miR-182 水平均低于对照组（P均<0.05）；SUB 组血清 miR-204、miR-182 水平低于非SUB组（P均<0.05），见表1、2。

2.2 血清miR-204、miR-182水平与直肠癌SUB患者临床病理参数的关系 血清miR-204、miR-182 水平与SUB直肠癌患者年龄、性别、TNM分期无关，与分化程度、淋巴结转移情况有关（P均<0.05）。见表3。

表1 观察组与对照组血清miR-204、miR-182水平比较（-x ± s）

表2 SUB组、非SUB血清miR-204、miR-182水平比较（-x± s）

表3 血清miR-204、miR-182水平与直肠癌SUB患者临床病理参数的关系

2.3 直肠癌患者术后血清miR-204、miR-182 水平与SUB发生的关系

2.3.1 影响直肠癌患者术后发生SUB 的单因素分析 SUB组和非SUB组性别比例、吸烟史比例、饮酒史比例、肝肾功能异常比例、术中出血量、术后使用糖皮质激素比例差异无统计学意义，两组年龄、术前合并心脑血管疾病比例、术后发生其他并发症比例比较差异有统计学意义（P<0.05）。见表4。

表4 影响直肠癌患者术后发生SUB的单因素分析［例（%）］

2.3.2 影响直肠癌患者术后发生SUB 的多因素分析 以直肠癌患者术后是否发生SUB 作为因变量，将年龄≥60 岁、合并心脑血管疾病、术后有其他并发症及血清miR-204、miR-182 水平作为自变量，进行Logistic 回归分析，结果显示，年龄≥60 岁、低水平miR-204、低水平miR-182 是影响直肠癌患者术后发生SUB的危险因素（P<0.05）。见表5。

2.4 SUB 组血清 miR-204 与 miR-182 水平的相关性 SUB 组患者血清miR-204 与miR-182 水平呈正相关（r=0.471，P<0.05）。

3 讨论

越来越多的研究发现，miRNA 在肿瘤的形成及发展过程中发挥重要作用。miRNA 参与肿瘤发展的分子机制一般为miRNA 位于基因组不稳定区或癌基因表达区，或者miRNA 在机体正常组织细胞和肿瘤细胞中差异性表达，通过调控细胞周期发挥致癌或抑癌基因作用。已有部分miRNA 分子被证实可作为某些癌症的药物治疗靶点及肿瘤诊断标志物，在对诊断肿瘤分型、判断患者预后等方面起重要的积极意义［8-9］。卞慧萍［10］利用 miRNA 定量 PCR 芯片从结直肠癌（CRC）患者血清中筛选出7 个差异性表达的miRNA，其中miR-204 表达显著升高，且对CRC 有一定的识别、诊断价值。而刘揆亮等［11］从结直肠瘤—腺癌序列中筛选出15 个差异表达的miR⁃NA，其中miR-204 表达显著低于正常对照。本研究结果显示，观察组血清miR-204 水平较对照组低，与刘揆亮等［11］结论一致，与卞慧萍［10］研究结果不一致，可能与操作者手法、地域差异、仪器设备等因素有关。另外，发生SUB 患者血清miR-204 水平低于未发生SUB 患者，提示miR-204 水平低可能与SUB 发生有关。

表5 影响直肠癌患者术后发生SUB的多因素分析

研究发现，miR-204位于人类染色体7q32上［12］，是脊椎动物基因中高度保守序列之一，可表达于机体多种组织及细胞中。近年来，关于miR-204 与肿瘤关系的研究成为热点。李丽霞等［13］研究发现，miR-204 在非小细胞肺癌（NSCLC）患者癌组织中表达低于癌旁组织，进一步研究发现miR-204 可能通过靶向SIRT1 表达对NSCLC 细胞的分化、增殖起抑制作用，提示miR-204 可能作为评估NSCLC 肿瘤分化程度及预后的新靶点。越来越多的研究表明，miR-204 可能通过抑制肿瘤相关靶基因表达或降解蛋白，对肿瘤的发生发展起抑制作用［14］，比如肺癌、乳腺癌等［15-16］。本研究结果发现，血清miR-204水平与直肠癌SUB 患者肿瘤分化程度、淋巴结转移情况有关，经Logistic回归分析可知，血清低水平miR-204是影响直肠癌患者术后发生SUB 的危险因素，提示血清miR-204 可能与直肠癌患者严重程度有关，可能通过靶向抑制某种蛋白转录，激活多种通路发挥抑癌基因作用，具体的作用机制有待进一步研究。

大量研究表明，miR-182 在肿瘤细胞中的表达具有差异性，对细胞增殖、迁移、凋亡起重要的调控作用。蒋华锋等［17］认为，miR-182 在直肠癌组织中呈高表达，并通过靶向调控p53 表达在肿瘤中发挥作 用 。 杨 洲 等［18］研 究 提 示 ，miR-182 可 负 调 控SATB2 表达，可能通过促进SW480 细胞神经钙黏素的增加，增强癌细胞的黏附、运动及生存能力起促癌基因作用。本研究结果显示，观察组血清miR-182水平低于对照组，且术后发生直肠癌SUB 患者的miR-182 水平高于未发生SUB 患者，经临床病理分析可知，miR-182 与直肠癌SUB 患者肿瘤分化程度、淋巴结转移情况有关，另外，血清低水平miR-182 是影响直肠癌患者术后发生SUB 的危险因素，提示miR-182 可能参与直肠癌患者SUB 的发生发展过程，与林德等［19］结果一致。本研究结果显示，术后发生 SUB 直肠癌患者血清 miR-204、miR-182 均低，且二者呈正相关关系，提示二者可能在SUB 的发展中起协同作用，但具体作用尚不明了。

综上所述，直肠癌术后患者血清miR-204、miR-182 水平低，且发生SUB 患者均低于未发生者，血清低水平miR-204、miR-182 可能与直肠癌术后发生SUB 有关。然而，关于 miR-204、miR-182 之间的相互作用以及在直肠癌中的具体作用机制有待更深入研究。