口腔鳞状细胞癌外周血、癌组织及癌旁组织中CD4+T、CD8+T淋巴细胞上TIM-3的表达及临床意义

闫秋杰，南丽君，赵芳源，李俊冉，张媛媛

(郑州大学第一附属医院 口腔科，河南 郑州 450052)

口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是头颈部最常见的恶性肿瘤之一，全球每年新发病例约35万例[1]。虽然近年来OSCC的诊断方法及综合治疗不断改进，但OSCC的5 a生存率仍仅为50%左右[2]。T淋巴细胞介导的细胞免疫在抗肿瘤反应中发挥核心作用。负性共刺激分子常位于T淋巴细胞或肿瘤细胞表面，在多种肿瘤细胞和免疫细胞上表达上调，使T淋巴细胞功能发生障碍，直接或间接促进肿瘤细胞免疫逃逸，进而导致肿瘤治疗失败。目前，针对免疫检验点PD-1单克隆抗体已被批准用于治疗OSCC在内的头颈部鳞状细胞癌，然而由于患者体内免疫耐受的产生，单一的免疫治疗效果并不理想。故采用联合免疫治疗来控制疾病的进展。有研究报道，T淋巴细胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3(T cell immunoglobulin mucin molecule-3，TIM-3)是大多数免疫细胞表面共抑制分子，半乳凝素-9是其配体，两者结合后可以抑制免疫应答，从而促进肿瘤的发生[3]。已在多种肿瘤中发现TIM-3在免疫调节中发挥关键作用。然而，TIM-3表达在OSCC中的生物学和临床价值尚未得到系统的阐明。本研究观察OSCC患者外周血、癌组织及癌旁组织中T淋巴细胞上TIM-3的表达情况，并分析其临床意义，旨在探讨TIM-3与疾病的关系，为OSCC的免疫靶向治疗提供理论基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2018年4月至2019年10月郑州大学第一附属医院收治的41例OSCC患者作为OSCC组，其中男25例，女16例，年龄36～87岁，平均(61.24±12.91)岁。选取同时期在郑州大学第一附属医院接受体检的20例健康体检者作为对照组，其中男13例，女7例，年龄37～83岁，平均(59.00±11.17)岁。两组性别、年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)。受试者知晓本研究内容并签署同意书。本研究经郑州大学第一附属医院医学伦理委员会批准。

1.2 入组标准(1)选取标准：①首次诊断为OSCC，且经病理HE染色确诊；②临床病理资料完整。(2)排除标准：①既往放化疗及免疫治疗史；②非原发肿瘤，或合并其他肿瘤；③伴有其他的口腔黏膜病，如口腔白斑、口腔扁平苔藓等；④合并其他系统性疾病。

1.3 标本采集与制备清晨空腹状态下采集受试者2 mL外周静脉血，置于肝素抗凝管内，2 h内上机检测。收集手术切除的OSCC组织以及癌旁2 cm以上的正常组织标本(苏木精-伊红染色证实无肿瘤细胞)。样本制备：取部分癌组织和对应癌旁组织在无菌操作台上剪成约1 mm3的碎块，分别加入含有链霉素(500 mg·L-1)、青霉素(500 IU·mL-1)及庆大霉素(900 IU·mL-1)的培养液内，并放入消化酶混合液中(体积分数为2%的胎牛血清，1 mg·L-1的CollagenaseⅠ、CollagenaseⅣ，25 mg·L-1的脱氧核糖核酸酶)消化30 min，采用100目滤网过滤溶液制备单细胞悬液。

1.4 检测方法流式法检测在CD4+T、CD8+T淋巴细胞上TIM-3的表达。取外周抗凝血、癌组织及癌旁组织单细胞悬液各100 μL分别置于EP管中，然后分别加入荧光标记(抗TIM-3-PE，抗FITC-CD8、抗PerCP-Cy5.5-CD4、抗APC-PD-1)抗体各5 μL至相应流式细胞管中，同型对照组各加入5 μL对应荧光标记的鼠抗人IgG抗体。避光孵育20 min后，于外周血离心管内分别加入1×的红细胞裂解液2 mL，震荡混匀，避光孵育15 min。癌组织和癌旁组织则无需此过程。取2 mL PBS缓冲液重悬洗涤2次，离心，弃上清。采用流式细胞仪BD FACSCantoTMⅡ上机分析。

2 结果

2.1 OSCC组和对照组外周血中CD4+T、CD8+T淋巴细胞上TIM-3的表达OSCC组外周血中CD4+T、CD8+T淋巴细胞上TIM-3表达水平[(4.02±0.68)%、(4.22±0.72)%]较对照组[(0.94±0.42)%、(1.24±0.65)%]高(t1=21.683，P1<0.001；t2=16.213，P2<0.001)。见图1。

图1 OSCC组和对照组外周血中CD4+T、CD8+T淋巴细胞上TIM-3的表达水平

2.2 癌组织与癌旁组织中CD4+T、CD8+T淋巴细胞上TIM-3的表达OSCC癌组织中CD4+T、CD8+T淋巴细胞上TIM-3表达水平[(23.03±3.61)%、(24.33 ±3.83)%]较对照组[(10.84±2.03)%、(10.62±1.28)%]高(t1=14.656，P1<0.001；t2=16.624，P2<0.001)。见图2。

图2 OSCC患者癌组织和癌旁组织中CD4+T、CD8+T淋巴细胞上TIM-3的表达水平

2.3 OSCC患者外周血中CD4+T、CD8+T淋巴细胞上TIM-3表达与临床病理指标的关系有淋巴结转移的OSCC患者外周血中CD4+T、CD8+T淋巴细胞上TIM-3的表达水平高于无淋巴结转移的患者(P<0.05)，OSCC患者外周血中CD4+T、CD8+T淋巴细胞上TIM-3的表达水平与年龄、性别、部位、肿瘤大小、病理学分级、TNM分期无关(P>0.05)。见表1、2。

表1 OSCC患者外周血中CD4+T淋巴细胞上TIM-3的表达与临床病理特征的关系

表2 OSCC患者外周血中CD8+T淋巴细胞上TIM-3的表达与临床病理特征的关系

2.4 OSCC患者癌组织中CD4+T、CD8+T淋巴细胞上TIM-3的表达与临床病理指标的关系TIM-3在OSCC患者癌组织中CD4+T、CD8+T淋巴细胞上的表达水平与年龄、性别、部位、肿瘤大小、病理学分级、TNM分期、淋巴结转移无关(P>0.05)。见表3、4。

表3 OSCC患者癌组织中CD4+T淋巴细胞上TIM-3的表达与临床病理特征的关系

表4 OSCC癌组织中CD8+T淋巴细胞上TIM-3的表达与临床病理特征的关系

3 讨论

负性共刺激分子介导的T淋巴细胞功能障碍机制复杂，研究报道单纯抗PD-1/PD-L1治疗有效率低[4]。Shayan等[5]研究显示，应用PD-1阻断剂治疗头颈部肿瘤有效率<20%，这些提示仅阻断PD-1/PD-L1并不能完全恢复T淋巴细胞功能，可能存在多种负调控途径参与抗肿瘤免疫反应。TIM-3是除PD-1之外重要的T淋巴细胞耗竭标志，应用PD-1阻断剂后TIM-3补偿性上调，TIM-3的上调可抑制T淋巴细胞的免疫功能，双重阻断TIM-3和PD-1可以恢复耗竭性T淋巴细胞分泌细胞因子的能力，增强其抗肿瘤效应。TIM-3在CD4+T、CD8+T淋巴细胞上表达上调与各种肿瘤发生发展密切相关，但对TIM-3在OSCC患者CD4+T、CD8+T淋巴细胞上的表达相关研究较少。本研究采用流式细胞术检测OSCC患者外周血、癌组织及癌旁组织中T淋巴细胞上TIM-3表达情况，探讨其与OSCC临床病理特征的关系，为OSCC的免疫靶向治疗提供理论基础。

T淋巴细胞参与适应性免疫应答在肿瘤发生发展中处于核心地位[5]。成熟的T淋巴细胞表面仅表达CD4+或CD8+[6]。CD4+辅助T淋巴细胞在适应性免疫反应的招募、激活和调节多个方面发挥着关键作用。CD8+T淋巴细胞应答的产生依赖于激活的CD4+T淋巴细胞的帮助。CD8+T淋巴细胞能特异性识别MHC-Ⅰ类分子呈递内源性抗原，CD4+T淋巴细胞辅助CD8+T淋巴细胞参与肿瘤免疫反应，进而杀伤肿瘤细胞[7]。研究表明，相比于PD-1，TIM-3更能作为体内T淋巴细胞耗竭的标志物，PD-1-TIM-3+CD8+T淋巴细胞使T淋巴细胞增殖分泌能力降低，而PD-1+TIM-3-CD8+T淋巴细胞与T淋巴细胞功能无明显相关性[8]。本研究发现，OSCC患者外周血CD4+T、CD8+T淋巴细胞上TIM-3表达水平均高于对照组，与结肠癌、骨肉瘤及OSCC体内研究结果[9-11]一致，提示TIM-3在OSCC患者CD4+T、CD8+T淋巴细胞上高表达可能抑制下游信号通路及细胞因子的分泌，致使外周T淋巴细胞功能障碍，导致肿瘤的发生。

此外，本研究发现，OSCC患者癌组织CD4+T、CD8+T淋巴细胞上TIM-3表达水平高于癌旁组织，与徐本玲等[12]研究结果一致，提示宿主与肿瘤之间的免疫反应极其复杂，肿瘤微环境中可能存在诱导其表达的因素，致使CD4+T、CD8+T淋巴细胞出现功能障碍，从而导致肿瘤微环境免疫抑制，促进肿瘤的发生发展。

本研究结果显示，OSCC患者外周血中CD4+T、CD8+T淋巴细胞上TIM-3的表达水平与年龄、性别、部位、肿瘤大小、病理学分级、TNM分期无关，仅与有无淋巴结转移相关，与以往的研究结果[10]一致，表明TIM-3在OSCC的发生发展中起负性调节作用，可能使T淋巴细胞出现功能障碍，耗竭性T淋巴细胞对肿瘤细胞杀伤能力减弱，从而促进肿瘤的发生与进一步转移[13]。Cheng等[14]研究显示胃癌癌组织中CD4+T、CD8+T淋巴细胞上TIM-3的表达水平与淋巴结转移、TNM分期等临床病理特征相关，而本研究中OSCC癌组织中CD4+T、CD8+T淋巴细胞上TIM-3的表达水平与年龄、性别、部位、肿瘤大小、病理学分级、TNM分期、淋巴结转移无关，可能是由于CD4+T、CD8+T淋巴细胞上TIM-3在不同肿瘤间表达存在差异。有研究证实，TIM-3、PD-1在多个肿瘤浸润淋巴细胞及外周血T淋巴细胞上均存在高表达、共表达现象，且与疾病的发生发展有关[15-16]。因此，TIM-3、PD-1在OSCC患者中的表达水平可共同作为判断OSCC患者预后的参考指标和治疗靶点。

综上所述，本研究结果支持TIM-3参与OSCC的免疫逃逸，TIM-3的过表达与OSCC的淋巴结转移有关，可能与OSCC的预后有关。但由于未对患者术后进行长期随访，不能准确分析患者的预后，这也将是下一步研究的重点。