石墨烯对生殖毒性的研究进展

张静，高玉，杨永秀，关徳凤

(1.兰州大学第一临床医学院，兰州 730000；2.济宁医学院第二临床医学院，济宁 272113；3.兰州大学第一医院生殖医学中心，兰州 730000)

石墨烯以氧化石墨烯(Graphene oxide，GO)、石墨烯量子点(Graphene quantum dots，GQDs)、单壁碳纳米管(Single-walled carbon nanotube，SWCNT)等多种结构形式存在。2004年，Konstantin等首次从石墨中分离出石墨烯，之后学者们围绕石墨烯在生物医学中的应用展开了大量研究，包括药物/基因传递、生物传感和成像、抗菌材料、细胞培养的生物相容性支架等。此外石墨烯氧化物结合808 nm近红外激光照射在癌症化学光热治疗中具有巨大的潜力，已经成为癌症治疗的新材料[1-2]。石墨烯尤其是GO对于各种生物体会有毒性作用。体内研究发现，石墨烯会在不同的组织和器官蓄积，并对血液循环系统、呼吸系统、免疫系统、神经系统和肝肾功能造成不同程度的危害[3]。原始和功能化的石墨烯纳米材料(Graphene nanomaterials，GNMs)在实验室哺乳动物中表现出潜在的肺毒性、系统性毒性、行为毒性、生殖毒性和发育毒性以及基因毒性[4]。体外实验表明，细胞或组织暴露于过量的GNMs会激活过量的活性氧(Reactive oxygen species，ROS)，从而影响细胞的代谢和呼吸，同时会有炎症反应的发生[3]，这可能是石墨烯的主要毒性机制。

一、石墨烯在生物器官中的蓄积

石墨烯颗粒可以有很多进入人体的途径，如皮肤接触、呼吸吸入、口腔黏膜以及眼结膜接触等。Liang等[5]的研究表明，分别通过尾静脉和腹部注射125I标记的GO 到雄性小鼠体内，从放射性水平来看，GO纳米片主要分布在四个器官：肝脏、脾脏、肺和肾；小鼠尾静脉注射后四个器官的GO浓度均显著高于腹部注射后四个器官的GO浓度。此外，GNMs会在生殖器官中蓄积，研究者在雄性小鼠体内注射5 mg/kg的功能化石墨烯后，虽然小鼠在体重、睾丸以及附睾的重量上均未发生明显变化，但是他们发现在处理10 min、60 min和24 h时睾丸中分别积累了41、61和151 ng的GNMs[6]。

目前对于石墨烯材料在生物器官的蓄积情况，实验者只发现该材料存在于肝脏、脾脏、肺脏和肾脏中，还需要更多的实验来探索石墨烯在其他生物器官的蓄积情况。

二、石墨烯的生殖毒性

1.体外实验：体外实验研究发现，石墨烯对于生殖细胞有一定的毒性，并且它的毒性作用存在一定的剂量依赖性，这与石墨烯的理化特性密切相关。GQDs的暴露使得昆明小鼠卵母细胞在体外成熟过程中未能排出第一个极体，导致第一次极体排出失败[7]。众所周知，卵母细胞的减数分裂主要依赖于卵母细胞骨架组织肌动蛋白帽的动态变化，这一变化在时间和空间上受到高度调控，同时在卵母细胞成熟过程中，纺锤体处于不对称位置是极体排出成功的关键[8-11]。研究者发现，GQDs暴露的小鼠卵母细胞成熟过程中纺锤体迁移和肌动蛋白帽形成失败，可能导致第一次极体排出失败[12]，从而影响卵母细胞的体外成熟；此外另有研究者发现，GQDs会阻断小鼠精母细胞系(GC-2)和正常小鼠睾丸Sertoli细胞(TM4)自噬通量[13]，促进细胞的凋亡[12]，可能对男性生殖有潜在的危害。GNMs的毒性取决于剂量、暴露时间、细胞类型和聚集程度等多种因素[14]。有文献报道，反复接触GNMs对于小鼠的睾丸会产生可逆性的损伤，但是对精子体外活力并没有很大的影响，并不影响生育能力[6]。但是也有研究发现，高剂量的GO可导致睾丸组织的损伤，包括生精小管萎缩、生发上皮细胞减少、生殖细胞丢失和空泡化[14]，由此影响精子活性。

Asghar等[15]的研究首次就还原GO对人类精子的毒性进行了初步评估，精子暴露于GO可能导致精子活力发生变化，但是根据世界卫生组织对精子运动性的评估标准，这种影响不会对人精子造成明显的伤害，然而孵育于还原性GO的精子会产生ROS，由于ROS的存在，精子的运动速度和氧化应激发生了明显的变化。氧化应激物质在浓度较高的情况下可能对男性生育能力产生不利影响。

上述结果表明，GNMs的暴露会导致哺乳动物生殖细胞的体外发育出现明显异常，极有可能影响生育功能。

2.体内实验：体内实验研究表明，石墨烯对于生殖功能有一定的影响，具体作用不尽相同。在交配前或妊娠早期给雌性小鼠注射GO，未见明显的生殖毒性，但是在临产期前注射高剂量的GO会出现死产和流产现象[16]；在哺乳期间，母体含GO，水的摄入量减少，可能会减少乳汁的分泌，从而影响后代的生长发育[17]。

Wistar大鼠腹腔暴露于3种剂量GO，即低剂量(0.4 mg/kg)、中剂量(2.0 mg/kg)和高剂量(10.0 mg/kg)，重复暴露15 d和30 d的大鼠附睾精子计数下降和异常精子增多，活动精子的百分比也因暴露而显著降低[14]。向性成熟雄性小鼠气管内灌注四种分散在纳米水中的GNMs，研究GNMs对肺炎后精子质量的影响，最后一次灌注后一周，暴露于纳米颗粒组的小鼠支气管肺泡液中性粒细胞显示持续的炎症反应，但是附睾精子参数、日精子产量和血浆睾酮水平均无显著变化[18]。通过灌胃或静脉注射，研究发现GQDs对雄性小鼠的性行为频率和时间没有影响，GQDs暴露的雄性小鼠睾丸和附睾的结构和功能、生殖生理(如健康精子的产生和储存、睾丸中正常的总蛋白和关键酶浓度的维持)也无明显影响，睾酮水平也保持正常，暴露于GQDs的雄鼠与雌鼠交配后第一、第二和随后一窝的幼鼠都健康[19]。总之，只有有限的资料表明，静脉注射还原GO和口服GO可能引起在体生殖毒性，但是在实际环境中，吸入石墨烯颗粒为石墨烯进入人体的主要方式，并且体外实验表明石墨烯对生殖细胞有一定的毒性，所以需要更多入体途径的研究来了解石墨烯的生殖毒性。

对其他模式生物的研究发现，除了哺乳动物，石墨烯对包括鱼类、线虫、水蚤和蟋蟀在内的多种生物的繁殖均有影响，并且对后代产生影响。两代蟋蟀长期暴露于食物中的GO，接受GO处理的两组蟋蟀的生殖能力都明显低于对照组[20]；GO可在斑马鱼幼虫的眼睛、心脏、卵黄囊和血管中积累累积[21]；Manjunatha等首次阐明了不同浓度原始石墨烯可导致斑马鱼胚胎心脏发育不全及其特定的心血管缺陷[22]，高浓度的GO(0.41 mg/ml)会导致显著的胚胎死亡率升高[23]；Kim等[24]研究发现GO会在秀丽隐杆线虫生殖器官中的累积，对精子形成抑制以及改变脂肪酸代谢从而对秀丽隐杆线虫产生生殖毒性损害。

三、石墨烯的毒性作用机制

纳米材料的性能和毒性与其物理和化学特性有关，如颗粒大小、结构、形状、表面积、表面电荷、溶解度、催化活性、表面涂层和表面活性基团等[21，25]。小尺寸的GNMs允许它们穿过细胞膜和其他生物屏障进入生物体，造成细胞损伤。研究发现，石墨烯的表面积与氧化电位呈正相关，体积更小、表面积更大的石墨烯对大鼠的氧化应激和DNA损伤表现出更高的功效[26]。ROS的产生是纳米材料最重要的毒性机制之一，可导致氧化应激、炎症、脂质过氧化，并造成蛋白质、细胞膜和DNA的损伤[27]。

不同的研究报道了GO介导不同类型细胞自噬和坏死相关的多种信号通路的激活[28]；表观遗传调控机制包括组蛋白修饰、DNA甲基化、染色体重塑和小RNA调控已被报道可诱导纳米毒性。在Sun等[27]的一项研究中，研究人员利用体外肾细胞系(HEK-293T)评估了GO使染色质结构改变的纳米毒性，结果显示其毒性的主要作用机制为激活了COX-2的高表达，从而促进炎症反应的发生，破坏染色质结构。此外，在生殖细胞的研究中显示，GNMs可以降低组织蛋白酶的数量和酶活性，抑制溶酶体蛋白水解能力，促进细胞凋亡；影响肌动蛋白帽的形成和第一极体排出，引起相关卵母细胞无法减数分裂，进而影响生殖活性[7，13]。

四、总结与展望

石墨烯是目前职业暴露较为广泛的纳米材料之一，由于其优异的理化特性而有广泛的应用前景。研究表明，石墨烯通过不同的途径进入生物体后，可以在生殖器官或组织中蓄积，引起各种组织生物损害，目前对石墨烯透过这类生物屏障的转运机制的了解比较少。体外实验表明，石墨烯暴露可以诱发生殖细胞的损伤；石墨烯在生殖细胞及组织内的蓄积和毒性与其粒径、表面涂层、接触的浓度和时间等因素相关；目前只有少数体内实验研究表明石墨烯对小鼠生殖系统有影响，可能与石墨烯入体途径有关，有待进一步研究。现有的资料表明，诱发细胞或组织内 ROS水平的升高是石墨烯造成细胞或系统毒性的主要原因。由于石墨烯的应用前景和潜在毒性，应该增多对石墨烯的生殖毒性研究，深入了解其在生殖系统的分布蓄积及其通过血睾屏障、胎盘屏障等生物屏障的转运机制，同时进一步研究其对生殖系统的影响和毒性作用机制，为石墨烯生物医用提供理论指导和依据。