通用型和O型口蹄疫病毒二重荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

王淑娟，王东方，刘 影，杨海波，赵胜杰，曹伟伟，王 翠，赵雪丽，马震原，闫若潜

(河南省动物疫病预防控制中心，河南 郑州 450008)

口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的一种急性、烈性、高度传染性、水疱性疾病，以发热，唇部、口腔黏膜、乳房及蹄部出现烂斑或水疱性病理变化为典型的临床特征[1-3]。该病主要感染牛、水牛，绵羊、山羊和猪在内的70多种偶蹄目动物[4]。该病广泛流行于世界各地，严重影响畜牧业生产、动物及其产品的流通和国际贸易，造成巨大的经济损失，世界动物卫生组织(OIE)和联合国粮农组织(FAO)将其列为A 类动物传染病之首，我国也将其列为一类动物疫病。

FMDV分为O型、A型、C型、亚洲Ⅰ型 (AsiaⅠ型)等7 个血清型[5]，各血清型的分布极其不均匀，A 型、O型、C型和AsiaⅠ型广泛分布，主要在欧洲、美洲、亚洲、非洲地区出现[6]。亚洲以东亚、东南亚和邻接中东地区疫情较严重，流行血清型以 A 型和 O 型为主[7]，我国以O型为主[8]。

FMDV感染猪以后引起的临床症状与塞尼卡病毒病、猪水疱病和水疱性口炎等难以区分，仅凭借临床症状和病理变化诊断FMDV存在一定困难。因此，建立一种快速、特异、敏感地检测FMDV的检测方法势在必行。病毒分离是检测病毒最可靠的方法，但该方法操作麻烦，检测周期长且需在特定的实验室中才能进行。病原核酸检测是实验室诊断最常用的方法，目前国内外已经建立了多种FMDV 核酸检测方法。酶联免疫吸附试验(ELISA)、反向间接血凝试验等方法敏感性不高； 国内外学者建立的RT-PCR和多重反转录聚合酶链式反应(mRT-PCR) 方法[9-10]，虽然具有较快速、特异的特点，但需要制胶、电泳等后续鉴定工作，操作复杂，而且增加了对实验室的污染 ； Madi等[11]，李金海等[12]建立了检测FMDV的荧光定量PCR (FQ-PCR)可以快速、敏感地检测FMDV，但不能分型。

本试验针对不同亚型FMDV通用序列(以下简称FMDV通用型)和O型FMDV序列设计了特异性引物和探针，提供了一种FMDV通用型(T型)和O型的二重TaqMan MGB FQ-PCR检测方法，在一个PCR体系中可同时对通用型和O型FMDV核酸进行快速、特异、敏感的检测，在确定是否为FMDV感染的同时，又能确定是否是O型FMDV感染，该方法不需要电泳鉴定，能够简化操作，为FMDV提供了快速、特异、灵敏的检测方法。

1 材料与方法

1.1 毒株、菌种与重组质粒 经灭活的口蹄疫病毒O型、A型与Asia Ⅰ型标准株细胞培养物，均购自国内某公司试剂盒阳性对照。BHK-21细胞、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、塞尼卡病毒(SVV)等，均由河南省动物疫病预防控制中心实验室提供。pGEM-T/FMDV-T(通用型)和pGEM-T/FMDV-O(O型)重组质粒：长度633 bp FMDV-T和234 bp FMDV-O特异性PCR扩增片段分别克隆入pGEM-T Easy载体，提取重组质粒后，通过紫外可见光分光光度计测定其OD260和OD280值，重复5次，确定质粒DNA的浓度，参考Kim等[13]介绍的方法计算其浓度，定量并稀释至 1.0×1010拷贝/μL，于-20 ℃冻存备用。

1.2 仪器和试剂 ABI 7500荧光定量PCR仪，购自美国ABI公司；KingFisher全自动核酸提取仪，购自美国Thermo Fisher公司；磁珠法核酸全自动提取试剂盒，购自Ambion生物科技公司；ExTaqDNA聚合酶、dNTPs、DNA回收试剂盒等，均购自宝生物工程(大连)有限公司；MLV反转录酶、RNA酶抑制剂、pGEM-T Easy载体、JM109感受态细胞，均购自Promega公司。

1.3 引物设计和合成 经大量比对GenBank中FMDV基因序列，选取不同亚型FMDV共有基因和O型 FMDVVP1基因高度保守且具有型特异性基因序列为模板，设计了1条特异性反转录引物FMDVR P0，2对特异性引物对FMDVT-F P1、FMDVT-R P2、FMDVO-F P3、FMDVO-R P4，2条TaqMan MGB探针FMDVT-MGB-FAM-Probe Probe-P5、FMDVO-MGB-VIC-Probe Probe-P6，引物和探针均由Invitrogen公司合成(表1)。

表1 引物与探针序列Table 1 The primers and probes sequences

1.4 样品核酸的提取和反转录 参照磁珠法核酸提取试剂盒说明书，采用Kinfisher全自动核酸仪分别提取经灭活的口蹄疫病毒O型、A型与Asia Ⅰ型标准株细胞培养物、BHK-21细胞对照、PEDV、TGEV、SVV的总RNA。经反复试验确定的最佳反转录体系为：M-MLV 5×Reaction Buffer(含Mg2+) 4 μL； 2.5 mmol/L dNTPs 4 μL；M-MLV 0.5 μL；RNA酶抑制剂 0.5 μL；反转录引物P0共1 μL；总体积10 μL。然后加入提取的不同样品总RNA共10 μL后，37 ℃水浴1 h进行反转录，反应结束后，70 ℃ 15 min 灭活反转录酶，反转录产物(cDNA)直接用于下步PCR扩增或-20 ℃冻存备用。

1.5 通用型和O型口蹄疫病毒二重FQ-PCR反应条件的优化 将pGEM-T/FMDV-T 和pGEM-T/FMDV-O重组质粒分别稀释至终浓度1.0×106拷贝/μL作为检测模板，P1/P2、P3/P4引物对分别稀释为终浓度0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 μmol/L 和1.0 μmol/L，Probe-P5、Probe-P6探针分别稀释到终浓度为0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 μmol/L和1.0 μmol/L，应用荧光PCR仪采用矩阵法筛选不同浓度的FMDV-T/FMDV-O引物和探针组合，筛选针对FMDV-T/FMDV-O的二重FQ-PCR最佳引物浓度、探针浓度和最佳反应条件。

1.6 敏感性试验和标准曲线的建立 将pGEM-T/FMDV-T和pGEM-T/FMDV-O重组质粒分别作等量混合，将其作为标准品，分别10倍系列稀释至终浓度为1.0×106～1.0×10-1拷贝/μL，共8个稀释度，按步骤1.5优化的FQ-PCR反应条件进行FMDV-T/FMDV-O二重FQ-PCR敏感性试验。分别以pGEM-T/FMDV-T和pGEM-T/FMDV-O重组质粒起始模板数的对数为X轴，以二重FQ-PCR循环次数Ct值为Y轴作回归曲线，建立二重FQ-PCR方法的标准曲线。

1.7 特异性检验 利用建立的二重FQ-PCR方法对PEDV、TGEV、SVV进行扩增，同时以经灭活的口蹄疫病毒O型、A型与Asia Ⅰ型标准株细胞培养物混合物为阳性对照，正常BHK-21细胞培养物为阴性对照，以验证该方法的特异性。

1.8 稳定性和重复性试验 分别将4个浓度(1.0×105～1.0×102拷贝/μL)的10倍系列稀释的pGEM-T/FMDV-T和pGEM-T/FMDV-O重组质粒等量混合物进行二重FQ-PCR扩增，每个系列设定3个重复，以验证该方法的稳定性和重复性。

1.9 应用试验 依据建立的FMDV-T/FMDV-O二重FQ-PCR和口蹄疫病毒O型、A型与AsiaⅠ型三重RT-PCR普通检测方法，配制检测试剂，以口蹄疫病毒O型、A型和Asia Ⅰ型细胞灭活病毒标准株单一培养物的等量混合物为阳性对照，正常BHK-21细胞培养物为阴性对照，对15份临床疑似FMDV感染样品(样品编号为：1～15)进行了应用检测，对这2种方法的检测结果进行比较分析，并与其测序结果比较。

2 结果

2.1 质粒DNA浓度的测定 通过紫外分光光度计分别测定pGEM-T/FMDV-T 和pGEM-T/FMDV-O重组质粒OD260平均值分别为2.360和2.457，OD280平均值分别为1.197和1.311，OD260/OD280平均值分别为1.971和1.873；参考质粒DNA拷贝数计算方法，计算出pGEM-T/FMDV-T 和pGEM-T/FMDV-O质粒拷贝数分别为1.81×1010拷贝/μL和1.88×1010拷贝/μL，均稀释至1.0×1010拷贝/μL。

2.2 FMDV-T/FMDV-O二重FQ-PCR反应条件 二重FQ-PCR反应体系25 μL：2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，10×ExTaq缓冲液 2.5 μL，5U/μLExTaq酶 0.25 μL；引物(20 μmol/L)P1/P2、P3/P4各0.5 μL，探针(10 μmol/L)Probe-P5 0.6 μL，探针(10 μmol/L)Probe-P6 0.8 μL；1.0×106拷贝/μL的质粒模板 2 μL，补ddH2O至25 μL。二重FQ-PCR反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s，40个 循环。最佳反应条件下的FQ-PCR结果见图1。

图1 FMDV-T/FMDV-O 二重FQ-PCR的扩增曲线Fig.1 The kinetic curve for FMDV-T/FMDV-O FQ-PCR1:FAM探针FMDV-T扩增曲线; 2:VIC探针FMDV-O扩增曲线; 3～4:阴性对照1:Kinetic curve for FMDV-T of FAM probe; 2:Kinetic curve for FMDV-O of VIC probe; 3～4:Negative control

2.3 FMDV-T/FMDV-O二重FQ-PCR敏感性及标准曲线 二重FQ-PCR检测FMDV-T和FMDV-O最低检出限均为1.0×101拷贝/μL(图2和图3)。由敏感性检测结果建立FMDV-T标准曲线，相关系数为0.999，斜率为-3.11，截距为36.10，从而可以得出拷贝数(X)与Ct值之间的线性关系表达式：Ct=-3.11×logX+36.1(图4)；由敏感性检测结果建立FMDV-O标准曲线，相关系数0.995，斜率为-3.28， 截距为35.29，从而可以得出拷贝数(X)与Ct值之间的线性关系表达式：Ct=-3.28×logX+35.29(图5)。

图2 FMDV-T FQ-PCR 的扩增曲线Fig.2 The kinetic curve for FMDV-T FQ-PCR1～8:对应的质粒浓度1.0×106, 1.0×105, 1.0×104,1.0×103, 1.0×102, 1.0×101, 1.0×100，1.0×10-1拷贝/μL； 9:阴性对照1～8: Plasmid concentration 1.0×106,1.0×105,1.0×104, 1.0×103, 1.0×102, 1.0×101,1.0×100， 1.0×10-1copies/μL, respectively； 9:Negative control

图3 FMDV-O FQ-PCR 的扩增曲线Fig.3 The kinetic curve for FMDV-O FQ-PCR1～8:对应的质粒浓度1.0×106, 1.0×105, 1.0×104,1.0×103, 1.0×102, 1.0×101, 1.0×100， 1.0×10-1拷贝/μL； 9:阴性对照1～8: Plasmid concentration 1.0×106, 1.0×105, 1.0×104,1.0×103, 1.0×102, 1.0×101,1.0×100， 1.0×10-1copies/μL，respectively； 9:Negative control

图4 FMDV-T FQ-PCR标准曲线Fig.4 The standard curve for FMDV-T FQ-PCR

图5 FMDV-O FQ-PCR标准曲线Fig.5 The standard curve for FMDV-O FQ-PCR

2.4 特异性 采用建立的FMDV-T/FMDV-O二重FQ-PCR方法对PEDV、TGEV、经灭活的口蹄疫病毒O型、A型与Asia Ⅰ型标准株细胞培养物混合物，正常BHK-21细胞培养物进行检测，结果显示，经灭活的口蹄疫病毒O型、A型与Asia Ⅰ型标准株细胞培养物混合物呈双阳性曲线扩增，Ct值分别为18.4和16.8，但正常BHK-21细胞培养物、PEDV、TGEV、SVV等均未出现特定的扩增曲线(图6)。

图6 FMDV-T/FMDV-O二重FQ-PCR方法的特异性试验Fig.6 Specificity test for FMDV-T/FMDV-O FQ-PCR1:FMDV-T质粒; 2:FMDV-O质粒; 3～7:正常BHK-21细胞培养物、PEDV、TGEV、SVV及阴性对照1:FMDV-T plasmid; 2:FMDV-O plasmid; 3～7:BHK-21，PEDV，TGEV，SVV and negative control

2.5 稳定性和重复性 采用建立的FMDV-T/FMDV-O二重FQ-PCR方法对4个浓度(1.0×105～1.0×102拷贝/μL)的10倍系列稀释的pGEM-T/FMDV-T和pGEM-T/FMDV-O重组等量质粒混合物进行检测，并且每个系列设定3个重复。结果表明，浓度为1.0×105、1.0×104、1.0×103拷贝/μL和1.0×102拷贝/μL的4个浓度的FMDV-T/FMDV-O重组质粒等量混合物3次试验结果均为阳性并且重复性良好，批内试验和批间试验变异系数均<0.04，说明建立的FMDV-T/FMDV-O二重FQ-PCR方法具有很好的稳定性和重复性(图7，表2，表3)。

2.6 临床样品检测 依据建立的FMDV-T/FMDV-O二重FQ-PCR和口蹄疫病毒O型、A型与Asia Ⅰ型三重RT-PCR普通检测方法，配制检测试剂，以口蹄疫病毒O型、A型和Asia Ⅰ型细胞灭活病毒标准株单一培养物的等量混合物为阳性对照，正常BHK-21细胞培养物为阴性对照，对15份临床疑似FMDV感染样品(样品编号：1～15)进行了应用检测，对这2种方法的检测结果进行比较分析，并与FMDV测序结果比较。

图7 FMDV-T/FMDV-O二重FQ-PCR方法的重复性试验Fig.7 Reproducibility test for FMDV-T/FMDV-O FQ-PCRT1-3:1.0×105拷贝/μL FMDV-T质粒； T4-6: 1.0×104拷贝/μL FMDV-T质粒； T7-9: 1.0×103拷贝/μL FMDV-T质粒； T10-12: 1.0×102拷贝/μL FMDV-T质粒； O1-3: 1.0×105拷贝/μL FMDV-O质粒； O4-6: 1.0×104拷贝/μL FMDV-O质粒； O7-9: 1.0×103拷贝/μL FMDV-O质粒； O10-12: 1.0×102拷贝/μL FMDV-O质粒；NC: 阴性对照T1-3: 1.0×105 copies/μL FMDV-T plasmid； T4-6: 1.0×104 copies/μL FMDV-T plasmid； T7-9: 1.0×103 copies/μL FMDV-T plasmid； T10-12: 1.0×102 copies/μL FMDV-T plasmid； O1-3: 1.0×105 copies/μL FMDV-O plasmid； O4-6: 1.0×104 copies /μL FMDV-O plasmid； O7-9: 1.0×103 copies/μL FMDV-O plasmid； O10-12: 1.0×102 copies/μL FMDV-O plasmid； NC: Negative control

测定结果如图8所示。结果表明，采用RT-PCR检测5份为FMDV-T阳性，4份为FMDV-O阳性，采用本试验建立的FMDV-T/FMDV-O二重FQ-PCR检测，9份为FMDV-T阳性，7份为FMDV-O阳性，该FQ-PCR方法检测结果与FMDV 共有基因、O型 FMDVVP1基因测序结果符合率为100%。将本试验部分疑似FMDV感染样品送国家口蹄疫参考实验室进行复核，结果确认为FMDV-O阳性[14]。表明本试验建立的FMDV-T / FMDV-O二重FQ-PCR方法比普通PCR方法的灵敏性高。

3 讨论

FMD是世界范围内严重影响畜牧业健康发展的恶性动物传染病，一旦暴发会对畜牧产业造成毁灭性的灾难[15]。《国家中长期动物疫病防治规划(2010-2020年)》也制定了FMD的控制和净化目标，这就要求我们必须加大监测力度，特别是加大病原学监测的范围和数量，因此，FMDV检测方法的快速、简便和高通量将越来越受到重视[16]。FQ-PCR技术具有敏感性高、特异性好、操作简单快捷，给检测工作带来很大便利。FQ-PCR技术分为染料法和探针法2种，Jamnikar等[17]对染料法和探针法进行了比较，认为探针法用于定量比SYBR Green I 染料法更为准确，且特异性更高。本试验建立的通用型和O型口蹄疫病毒二重FQ-PCR检测方法采用了TaqMan MGB探针，与传统的TaqMan探针相比，TaqMan MGB探针缩短了探针的长度，大大提高了探针的Tm值，也降低了探针的合成成本，TaqMan MGB探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团，其本身不产生荧光信号，可大大降低本底信号的强度，使扩增结果更加特异、敏感[18]。

表2 FMDV-T的二重FQ-PCR方法重复性Table 2 The results of FMDV-T reproducibility

表3 FMDV-O的二重FQ-PCR方法重复性Table 3 The results of FMDV-O reproducibility

图8 临床样品检测Fig.8 Detection of clinical samples

本试验在一个PCR反应体系中进行FMDV通用型和O型的二重检测反应，同时收集代表FMDV通用型和O型的荧光信号，对扩增产物进行实时在线检测，从而建立了能够同时检测 FMDV 通用型及O型二重FQ-PCR 方法。实验室及临床样品检测试验结果表明，该方法具有操作简便快速、特异性强、敏感性高等优点，为通用型和O型FMDV的快速检测提供了一种新方法。

目前，我国主要流行 O 型和 A 型 FMD，而 AsiaⅠ型自 2009 年之后未见临床病例报道[19]，并且国家已退出 AsiaⅠ型 FMD 的强制免疫，主要针对 FMDV 的 O 型和 A 型进行病原鉴别诊断。因此仍需在本试验的基础上，进一步开发针对FMDV通用型、O型和A型的荧光定量PCR检测方法。