睡菜环烯醚萜苷类成分及其α-葡萄糖苷酶抑制活性

陈静文，林 芳，金 冠，何芷芸，张志麒，刘呈雄，陈剑锋，邹 坤，程 凡*

(1.三峡大学生物与制药学院天然产物研究与利用湖北省重点实验室(三峡大学)，湖北 宜昌 443002；2.神农架国家公园管理局，湖北 神农架林区 442400)

睡菜(MenyanthestrifoliateL.)为龙胆科睡菜属多年生挺水植物，以全草入药，具“食之令人思睡”的功效，故又称“醉草、瞑菜”.睡菜在我国民间被认为药食两用的药用草本，有养心安神、健脾消食、清热利尿的作用.睡菜中主要的化学成分包括萜类(包括环烯醚萜类、三萜类等)、生物碱类、木脂素类、黄酮类等[1-5].睡菜为龙胆科单属种植物，其药用价值及化学成分研究具有重要价值.环烯醚萜苷类化合物在睡菜草本中含量丰富，报道相较其余成分类型较多，然而睡菜中具体的环烯醚萜苷类成分仍不明确，有待发现的价值.本课题对睡菜全草进行分离纯化，共得到6个化合物，分别鉴定为7-epiexaltoside(1)、6″，7″-dihydro-7-epiexaltoside(2)、獐牙菜苷(3)、断马钱子苷半缩醛内酯(4)、表断马钱子苷半缩醛内酯(5)、马钱子苷(6)，均为环烯醚萜苷成分.其中，化合物2～5为首次从该植物中分离得到.糖尿病是一种危害性极大且目前无特效药的代谢性疾病，以持续高血糖为主要特征，并以其各类并发症的危害性严重影响现代人们的生活.何丽华等[6]的研究指出山茱萸中环烯醚萜苷成分降血糖作用类似于α-葡萄糖苷酶抑制剂阿卡波糖的作用.抑制α-葡萄糖苷酶活性是目前糖尿病降血糖研究的热点机制，为了解睡菜中环烯醚萜苷类成分对糖尿病的作用，本文首次对睡菜中分离得到的6个环烯醚萜苷成分进行α-葡萄糖苷酶活性的体外筛选，均表现出良好的α-葡萄糖苷酶活性抑制效果，其中化合物3的抑制效果最佳.

1 材料与方法

1.1 仪器

C18反相色谱硅胶(YMC公司)；薄层色谱硅胶GF254(青岛海洋化工有限公司)；正相色谱硅胶(烟台化工研究所)；AB-8大孔吸附树脂(天津市光复精细化工研究所)；Dionex Ultimate 3000型高效液相色谱仪(美国戴安公司)；Sephadex LH-20(美国GE公司)；Cosmosil MS-II RP-C18色谱柱(250×10 mm，10 μm半制备型；250×4.6 mm，5 μm分析型，日本Cosmosil公司)；Waters 2489型高效液相色谱仪(美国Waters公司)；AmozonSL+1200液相色谱-双重漏斗传输离子阱质谱仪(德国布鲁克·道尔顿公司)；Bruker AV 400核磁共振波谱仪(瑞士布鲁克公司)；低温冷冻干燥机(美国Labconco公司，型号：021125535E)；BioTek ELx800全自动酶标仪(美国宝特公司)；电子天平(上海民桥精密仪器有限公司，型号：FA2004).

1.2 材料与试剂

实验用睡菜采自湖北省神农架，采摘时间为2016年8月，经由三峡大学王玉兵博士(生物与制药学院)鉴定：该植物为龙胆科睡菜属睡菜(MenyanthestrifoliateL.)，标本保存于三峡大学生物与制药学院.

α-葡萄糖苷酶(酵母)、阿卡波糖(美国Sigma-Aldrich公司)、4-硝基酚-α-D-吡喃葡糖苷(PNPG，美国Sigma-Aldrich公司).色谱纯甲醇(TEDIA公司)、色谱纯乙腈(TEDIA公司)，其他试剂均为分析纯.

1.3 提取与分离

睡菜全草粉碎后置于48 ℃干燥箱中烘干2 h，干重2.3 kg，以95%乙醇浸泡，加热(78 ℃)回流提取2 h，收集滤液，此操作重复3次.滤液混合，经减压加热后，浓缩干燥得到252 g睡菜浸膏，加水混悬均匀，依次用石油醚(PE)、乙酸乙酯(EA)、正丁醇(BA)分级萃取，萃取液分别收集进行减压浓缩干燥.取BA部位(85 g)，以蒸馏水对其进行混悬，以AB-8大孔吸附树脂柱色谱进行分离，依次以蒸馏水，30%、60%、90%乙醇水溶液进行洗脱，得到4个洗脱馏分(Fr.B1～Fr.B4).取Fr.B3馏分(18 g)，通过C18反相硅胶柱色谱进行分离，以甲醇-水洗脱(梯度为甲醇∶水=1∶9～1∶0)，经HPLC分析后，合并得到6个馏分(Fr.B3-1～Fr.B3-6).Fr.3-3馏分(2.0 g)经Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱色谱分离，甲醇-水洗脱(梯度为甲醇∶水=1∶1)，再以半制备HPLC(乙腈∶水=26∶74)纯化，得到化合物1(12.4 mg)，化合物2(14.7 mg)，化合物4(10.7 mg)，化合物6(22.4 mg).Fr.B3-5馏分(2.0 g)经Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱色谱分离，甲醇-水洗脱(梯度为甲醇∶水=1∶1)，再以半制备HPLC(乙腈∶水=31∶69)纯化，得到化合5(18.8 mg).取Fr.B2馏分(29 g)，以C18反相硅胶色谱柱进行分离，以甲醇-水洗脱(梯度为甲醇∶水=1∶9～1∶0)，经HPLC分析，合并得到9个馏分(Fr.B2-1～Fr.B2-9).Fr.B2-4流分(4.3 g)经Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱色谱分离，甲醇-水洗脱(梯度为甲醇∶水=1∶1)，再以半制备HPLC(乙腈∶水=19∶81)纯化，得到化合物3(18.2 mg).

1.4 α-葡萄糖苷酶活性筛选实验

根据文献[7]的方法，以PNPG为底物，阿卡波糖为阳性对照，在96微孔板上进行活性检测.过程为：1)空板中加 PBS缓冲液(pH=6.8)60 μL；2)加入α-葡萄糖苷酶溶液(浓度为0.8 U·mL-1)20 μL ；3)加入样品溶液(适当浓度)60 μL，37 ℃恒温环境孵育15 min；4)加入 PNPG(浓度为5 mmoL·L-1)20 μL，置于37 ℃恒温环境下反应15 min；5)加入Na2CO3溶液(浓度为0.2 moL·L-1)80 μL终止反应；6)测定吸光度(A)值(波长选定405 nm).同时设样品组(待测化合物+PBS+PNPG+酶)，样品空白组(待测化合物+PBS+酶)，酶活性组(PBS+PNPG+酶)，酶空白组(PBS+酶).抑制率的计算公式：

α-葡萄糖苷酶抑制率(%)=1-[(A样品组-A样品空白组)·(A酶活性组-A酶空白组)-1]×100%.

每组各重复3次，用软件Origin 9.1计算IC50值.

2 结果与分析

2.1 结构鉴定

化合物1：白色无定形粉末.ESI-MSm/z：563 [M+Na]+，分子式C26H36O12.Molish反应呈阳性，推测化合物为苷类化合物；香草醛显色剂加热，化合物显红色.1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)谱与文献[8]比对，可以将化合物分为3个部分，苷元部分有3个烯烃质子信号δH 7.62(1H，d，J=2.4 Hz)、δH 5.48(1H，m)、δH 5.38～5.28(2H，m)；取代基部分看到2个烯烃质子信号δH 6.80(1H，td，J=7.4，1.6 Hz)、δH 5.45(1H，m)；以及糖的质子信号.13C-NMR(100 MHz，DMSO-d6)谱中苷元部分有1个羰基碳信号δC(165.2)；4个烯烃碳信号δC(153.3)、δC(103.1)、δC(132.0)、δC(120.9).取代基部分1个羰基碳信号δC(162.9)；4个烯烃碳信号δC(126.6)、δC(144.3)、δC(134.8)、δC(125.8)；2个甲基碳信号δC(12.1)、δC(16.2)；糖部分1个端基碳信号δC(98.6).推测化合物为母核为裂环环烯醚萜，带香叶基的苷类化合物，与文献[9]报道对比，数据基本一致，故鉴定化合物1为7-epiexaltoside.其具体的1H-NMR和13C-NMR数据如下，1H-NMR(400 MHz，CD3OD)δH：7.66(1H，d，J=2.5 Hz，H-3)，6.85(1H，m，H-3″)，6.62(1H，t，J=1.9 Hz，H-7)，5.55(1H，s，H-1)，5.53(1H，m，H-8)，5.41(1H，m，H-7″)，5.38-5.29(2H，m，H-10)，4.73(1H，J=7.7 Hz，H-1′)，4.06(2H，d，J=6.6 Hz，H-8″)，3.47～3.35(1H，m，H-5)，2.76(1H，m，H-9)，2.38(2H，m，H-4″)，2.17(2H，t，J=7.4 Hz，H-5″)，1.86～1.98(2H，m，H-6)，1.86(3H，s，H-9″)，1.71(3H，s，H-10″).13C-NMR(100 MHz，CD3OD)δC：98.9(C-1)，155.3(C-3)，104.4(C-4)，23.2(C-5)，29.3(C-6)，93.8(C-7)，133.1(C-8)，43.5(C-9)，121.2(C-10)，167.2(C-11)，101.1(C-1′)，74.8(C-2′)，78.3(C-3′)，71.4(C-4′)，78.4(C-5′)，62.6(C-6′)，166.2(C-1″)，128.4(C-2″)，145.5(C-3″)，28.2(C-4″)，38.9(C-5″)，137.4(C-6″)，125.8(C-7″)，59.4(C-8″)，12.3(C-9″)，16.2(C-10″).

化合物2：白色无定形粉末.ESI-MSm/z：563 [M+Na]+，分子式C26H36O12.Molish反应呈阳性，推测化合物为苷类化合物；香草醛显色剂加热，化合物显红色.1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)谱与文献[9]比对，可以将化合物分为3个部分，发现苷元部分有3个烯烃质子信号δH 7.62(1H，d，J=2.4 Hz)、δH 5.48(1H，m)、δH 5.27～5.39(2H，m)；取代基部分看到1个烯烃质子信号δH 6.81(1H，td，J=7.6，1.6 Hz)、δH 5.48(1H，m)；以及糖的质子信号.13C-NMR(100 MHz，DMSO-d6)谱中苷元部分有1个羰基碳信号δC(165.2)；4个烯烃碳信号δC(153.3)、δC(103.1)、δC(132.0)、δC(120.9).取代基部分1个羰基碳信号δC(162.9)；2个烯烃碳信号δC(126.3)、δC(145.0)；2个甲基碳信号δC(12.1)、δC(19.3)；糖部分1个端基碳信号δC(98.6).推测化合物为母核为裂环环烯醚萜，带香叶基的苷类化合物，与文献[10]报道对比，数据基本一致，故鉴定化合物2为6″，7″-dihydro-7-epiexaltoside.其1H-NMR和13C-NMR数据如下，1H-NMR(400 MHz，CD3OD)δH：7.65(1H，d，J=2.3 Hz，H-3)，6.85(1H，m，H-3″)，6.61(1H，t，J=2.1，H-7)，5.56(1H，d，J=1.7 Hz，H-1)，5.49(1H，m，H-8)，5.39～5.27(2H，m，H-10)，4.71(1H，J=7.8 Hz，H-1′)，3.61(2H，m，H-8″)，3.44～3.35(1H，m，H-5)，2.75(1H，m，H-9)，1.98～1.88(2H，m，H-6)，2.23(2H，m，H-4″)，1.84(3H，s，H-9″)，1.61～1.49(2H，m，H-7″)，1.59～1.44(2H，m，H-5″)，1.41(1H，m，H-6″)，0.93(3H，d，J=6.7 Hz，H-10″).13C-NMR(100 MHz，CD3OD)δC：99.2(C-1)，155.3(C-3)，104.5(C-4)，27.2(C-5)，30.8(C-6)，93.8(C-7)，133.0(C-8)，43.5(C-9)，121.6(C-10)，167.2(C-11)，100.6(C-1′)，74.6(C-2′)，78.4(C-3′)，71.4(C-4′)，78.2(C-5′)，62.6(C-6′)，166.2(C-1″)，127.8(C-2″)，146.1(C-3″)，27.3(C-4″)，40.5(C-5″)，23.2(C-6″)，36.7(C-7″)，61.1(C-8″)，12.2(C-9″)，19.8(C-10″).

化合物3：白色无定形粉末.ESI-MSm/z：381 [M+Na]+，分子式C16H22O9.Molish反应呈阳性，推测化合物为苷类化合物；香草醛显色剂加热，化合物显红色.1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)谱与文献[11]比对，可以看到苷元3个烯烃质子信号δH 7.49(1H，d，J=2.5 Hz)、δH 5.48(1H，m)、δH 5.25(1H，dd，J=10.1，2.3 Hz，H-10a)，δH 5.32(1H，dd，J=17.2，2.2 Hz，H-10b)；13C-NMR(100 MHz，DMSO-d6)谱中可以看到一个端基碳信号δC(98.5)；1个羰基碳信号δC(165.1)；4个烯烃碳信号δC(151.9)、δC(105.3)、δC(132.8)、δC(120.8).推测化合物为裂环环烯醚萜苷类化合物，与文献[11]报道对比，数据基本一致，故鉴定化合物3为獐牙菜苷.其1H-NMR和13C-NMR数据如下，1H-NMR(400 MHz，CD3OD)δH：7.59(1H，d，J=2.5 Hz，H-3)，5.60-5.50(1H，m，H-8)，5.54(1H，d，J=1.8 Hz，H-1)，5.32(1H，dd，J=14.2，1.7 Hz，H-10b)，5.25(1H，dd，J=8.6，1.8 Hz，H-10a)，4.69(1H，d，J=7.8 Hz，H-1′)，4.48～4.32(2H，m，H-7)，2.69(1H，ddd，J=9.4，5.4，1.5 Hz，H-9)，1.80～1.65(2H，m，H-6).13C-NMR(100 MHz，CD3OD)δC：98.2(C-1)，153.9(C-3)，106.3(C-4)，28.2(C-5)，25.7(C-6)，69.4(C-7)，132.8(C-8)，44.0(C-9)，120.8(C-10)，168.1(C-11)，99.5(C-1′)，74.6(C-2′)，78.8(C-3′)，71.5(C-4′)，77.8(C-5′)，62.5(C-6′).

化合物4：白色无定形粉末.ESI-MSm/z：389 [M+H]+，分子式C17H24O10.Molish反应呈阳性，推测化合物为苷类化合物；香草醛显色剂加热，化合物显红色.1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)中可以看到苷元3个烯烃质子信号δH 7.55(1H，d，J=2.0 Hz)、δH 5.46(1H，m)、δH 5.28(1H，dd，J=10.1，2.3 Hz，H-10a)、δH 5.36(1H，dd，J=17.2，2.0 Hz，H-10b)；1个甲氧基质子信号δH 3.46(3H，s).13C-NMR(101 MHz，DMSO-d6)中可以看到1个端基碳信号δC(98.9)；1个甲氧基碳信号δC(56.5)；4个烯烃碳信号δC(152.2)、δC(104.3)、δC(133.6)、δC(121.4).推测化合物为裂环环烯醚萜苷类化合物，与文献[12]报道对比，数据基本一致，故鉴定化合物4为断马钱子苷半缩醛内酯.其1H-NMR和13C-NMR数据如下，1H-NMR(400 MHz，CD3OD)δH：7.57(1H，d，J=2.4 Hz，H-3)，5.55(2H，d，J=1.2 Hz，H-1)，5.46(1H，m，H-8)，5.32(1H，s，H-7)，5.30(1H，m，H-10a)，5.26(1H，m，H-10b)，4.65(1H，d，J=7.8 Hz，H-1′)，3.55(3H，s，—OCH3)，3.15(1H，m，H-5)，2.64(1H，m，H-9)，1.95(1H，m，H-6a)，1.45(1H，m，H-6b).13C-NMR(100 MHz，CD3OD)δC：98.1(C-1)，154.1(C-3)，105.2(C-4)，25.0(C-5)，31.8(C-6)，105.6(C-7)，133.0(C-8)，43.8(C-9)，121.4(C-10)，167.6(C-11)，99.9(C-1′)，74.7(C-2′)，77.8(C-3′)，71.5(C-4′)，78.5(C-5′)，62.6(C-6′)，57.2(—OCH3).

化合物5：白色无定形粉末.ESI-MSm/z：389 [M+H]+，分子式C17H24O10.Molish反应呈阳性，推测化合物为苷类化合物；香草醛显色剂加热，化合物显红色.1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)中可以看到苷元3个烯烃质子信号δH 7.55(1H，d，J=2.0 Hz)、δH 5.46(1H，m)、δH 5.28(1H，dd，J=10.1，2.3 Hz，H-10a)、δH 5.36(1H，dd，J=17.2，2.0 Hz，H-10b)；1个甲氧基质子信号δH 3.46(3H，s).13C-NMR(101 MHz，DMSO-d6)中可以看到1个端基碳信号δC(98.9)；1个甲氧基碳信号δC(56.5)；4个烯烃碳信号δC(152.2)、δC(104.3)、δC(133.6)、δC(121.4).推测化合物为裂环环烯醚萜苷类化合物，与文献[12]报道对比，数据基本一致，故鉴定化合物5为表断马钱子苷半缩醛内酯.其1H-NMR和13C-NMR数据如下，1H-NMR(400 MHz，CD3OD)δH：5.46(1H，s，H-1)，7.53(1H，d，J=2.0 Hz，H-3)，3.00(1H，m，H-5)，1.59(1H，d，J=12.0 Hz，H-6a)，1.83(1H，d，J=13.2Hz，H-6b)，5.31(1H，dd，J=9.6，2.0 Hz，H-7)，5.46(1H，m，H-8)，2.63(1H，dd，J=6.0，1.6 Hz，H-9)，5.28(1H，dd，J=10.1，2.3 Hz，H-10a)，5.36(1H，dd，J=17.2，2.0 Hz，H-10b)，3.46(3H，s，-OCH3).13C-NMR(100 MHz，CD3OD)δC：98.6(C-1)，154.4(C-3)，105.2(C-4)，23.0(C-5)，30.3(C-6)，103.5(C-7)，133.6(C-8)，42.9(C-9)，121.2(C-10)，167.4(C-11)，100.2(C-1′)，74.6(C-2′)，78.2(C-3′)，71.5(C-4′)，78.3(C-5′)，62.5(C-6′)，57.1(—OCH3).

化合物6：白色无定形粉末.ESI-MSm/z：389 [M+H]+，分子式C17H26O10.Molish反应呈阳性，推测化合物为苷类化合物.10%浓硫酸—乙醇溶液，加热显紫红色.1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)中可以看到1个烯烃质子信号δH 7.37(1H，d，J=1.0 Hz)；1个甲基质子信号δH 1.00(3H，s)；1个甲氧基质子信号3.64(3H，s).13C-NMR(101 MHz，DMSO)中可以看到2个烯烃碳信号δC(112.1)、δC(150.6)；1个甲基碳信号δC(13.5)；1个甲氧基碳信号δC(51.0)；1个糖端基碳信号δC(98.6).与文献[11]报道对比，数据基本一致，故鉴定化合物6为马钱子苷.其1H-NMR和13C-NMR数据如下，1H-NMR(400 MHz，CD3OD)δH：7.37(1H，d，J=1.1 Hz，H-3)，5.28(1H，d，J=4.5 Hz，H-1)，4.62(1H，d，J=7.8 Hz，H-1′)，4.01(1H，m，H-7)，3.66(3H，s，-OCH3)，3.10(1H，m，H-5)，2.21(1H，m，H-6b)，2.01(1H，m，H-9)，1.88(1H，m，H-8)，1.60(1H，m，H-6a)，1.10(3H，s，H-10).13C-NMR(100 MHz，CD3OD)δC：97.5(C-1)，151.8(C-3)，114.1(C-4)，31.9(C-5)，42.8(C-6)，75.2(C-7)，42.6(C-8)，46.7(C-9)，13.5(C-10)，167.0(C-11)，100.1(C-1′)，74.6(C-2′)，78.3(C-3′)，71.5(C-4′)，78.5(C-5′)，62.6(C-6′)，51.7(—OCH3).

化合物1～6化学结构式见图1.

2.2 α-葡萄糖苷酶活性筛选结果

筛选结果如表1所示.化合物1～6均可具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用，其中化合物3对α-葡萄糖苷酶的抑制表现最为显著，接近于阿卡波糖.

表1 各化合物对α-葡萄糖苷酶的影响Tab.1 The influences of α-Glucosidase

3 讨论

龙胆科植物富含环烯醚萜苷类成分[12]，睡菜作为龙胆科植物，同样富含环烯醚萜苷类成分.本研究对睡菜正丁醇部位进行针对性分离纯化，得到6个环烯醚萜苷类化合物.环烯醚萜苷类成分具有降血糖、抗炎、免疫抑制等多种药理活性[13].糖尿病是由高血糖引起的慢性代谢紊乱疾病，控制血糖是治疗糖尿病的基础，以天然产物抑制α-葡萄糖苷酶活性是调节碳水化合物代谢和高血糖的新型口服策略[14]，也是目前研究天然药物降血糖治疗的热点方向，常用的α-葡萄糖苷酶抑制剂主要有阿卡波糖和伏格列波糖等.已有研究显示山茱萸、玄参等天然药用植物中环烯醚萜苷类化合物进行糖尿病相关研究，指出天然药物在防治糖尿病及其并发症方面具有安全、有效、毒副作用小、多靶点、多效应、多功能性等优势，环烯醚萜苷类成分对糖尿病极其并发症的调节机制有抑制α-葡萄糖苷酶降低糖尿病血糖水平、减弱胰岛β细胞损伤或改变受损的β细胞、抑制氧化应激减轻肾脏病理性改变等[6，15-16].本实验对睡菜正丁醇部位进行化学成分研究，得到6个环烯醚萜苷类化合物.为了验证这6个环烯醚萜苷类化合物是否具有降血糖作用，对其分别进行了α-葡萄糖苷酶抑制活性筛选，我们对酶促反应可能的影响因素如温度、pH、酶浓度、终止剂浓度、水解时间等进行严格把控排除外界因素干扰以保证实验的可靠性，最终活性筛选结果表明6个环烯醚萜苷类化合物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用虽皆不及阿卡波糖，但均表现抑制效果.其中化合物3的抑制作用最为显著，其IC50值为6.63±0.38，效果最为接近阿卡波糖.化合物1、2对α-葡萄糖苷酶相较化合物3效果较弱，化合物4、5、6则抑制效果更弱.上述均提示睡菜中提取的环烯醚萜苷类成分具有降血糖作用，对糖尿病具有一定的干预效果，其机制可能与抑制α-葡萄糖苷酶活性，减缓体内糖类水解，维持体内血糖水平有关.本实验为研究环烯醚萜苷类成分的α-葡萄糖苷酶抑制活性提供了科学参考，同时也提供了防治糖尿病及并发症的天然药物研究素材，也为完善睡菜药理活性方面提供了糖尿病研究基础.

图1 睡菜中化合物的结构式Fig.1 Chemical constituents from Menyanthes trifoliate L．