四川泡菜强化发酵工艺初探

敖军，毛祥,2*

(1.四川轻化工大学 生物工程学院，四川 宜宾 644000;2.四川轻化工大学 食品产业技术研究院，四川 宜宾 644000)

四川泡菜是在低盐条件下，乳酸菌发酵产生乳酸，抑制其他有害微生物生长发育而成的发酵食品，含有丰富的营养物质，还具有一定的促消化、抑菌、预防疾病、降低胆固醇等作用[1-3]。在四川泡菜的发酵过程中，主导发酵的菌种有功能乳酸菌、酵母菌等，陈功[4]通过研究四川不同区域泡菜中优势微生物的菌群和生态分布确定了植物乳杆菌、肠膜明串珠菌、短乳杆菌、耐乙醇片球菌等功能乳酸菌是四川泡菜发酵的优势菌群。李南薇[5]对接种乳酸菌发酵泡菜的研究发现，与自然发酵泡菜相比较，人工接种乳酸菌发酵泡菜能明显缩短泡菜的发酵周期。敖晓琳等[6]认为功能乳酸菌的接种量对于泡菜口感的影响较小，但是对于泡菜产酸的速率，功能乳酸菌活菌数量的影响较大。酵母菌群在四川泡菜发酵过程中能够消耗泡菜发酵前期环境中的氧气，为泡菜后续发酵营造良好环境，而且赋予泡菜特殊的风味物质，如酯类、有机酸等。曾骏[7]认为酵母菌在泡菜发酵过程中也会产生一部分有机酸，对于泡菜的风味和酸度起到一定的作用，并且在大量的实验后得出酸度和原材料是影响泡菜中酵母菌形态变化的重要因素。近年来，都侧重研究单一功能菌株对于泡菜发酵的影响和形态变化，对功能乳酸菌、酵母菌结合的研究和泡菜强化发酵工艺方面的研究较少[8]。因此，本文主要通过接种不同浓度梯度的功能乳酸菌、酵母菌，研究泡菜发酵过程中乳酸、总酯的含量及变化情况的影响，并在功能乳酸菌与酵母菌的最适接种量下，探究功能乳酸菌、酵母菌的最适产酸、产酯温度，初步建立四川泡菜的强化发酵工艺，为提升泡菜品质，缩短泡菜发酵周期，促进泡菜工业化、标准化纯种发酵生产提供了理论依据[9]。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 试验材料及菌种

白萝卜、桂皮、八角、花椒、糖、香叶、白酒、食盐：购于绿源超市；功能乳酸菌、酵母菌：实验室提供。

1.1.2 实验设备、试剂

GZ-250-HSⅡ恒温恒湿箱 韶关市广智科技设备有限公司；LRH-250生化培养箱 上海博讯实业有限公司；T6新世纪紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；GR6F立式自动压力蒸汽灭菌器、RJ-TDL-5低速台式大容量离心机 天津市泰斯特仪器有限公司；SKY-210摇床 奥豪斯仪器(上海)有限公司。

琼脂、葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨：以上均为生化试剂；氯化钠、柠檬酸氢二铵、吐温80、磷酸氢二钾、乙酸钠、硫酸镁、硫酸锰、硫酸、氢氧化钠、邻苯二甲酸氢钾、碳酸钠：以上均为分析纯。

1.1.3 培养基

MRS固体培养基: 蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母膏5 g、柠檬酸氨二铵2 g、葡萄糖20 g、吐温80 1 mL、 磷酸氢二钾2 g、乙酸钠5 g、硫酸镁0.5 g、硫酸锰0.2 g、琼脂粉18 g、蒸馏水1000 mL，pH 6.2～6.6。

YPD固体培养基：酵母膏10 g、蛋白胨20 g、蒸馏水900 mL、琼脂20 g、20%葡萄糖100 mL。

液体培养基与固体培养基成分相同，但不需添加琼脂。

1.2 实验方法

1.2.1 泡菜制作工艺流程

选材→清洗→切片→装瓶→加入功能乳酸菌与酵母菌→加盐水→封瓶→恒温发酵。

泡菜盐水：向7000 mL清水中放入花椒2 g、八角2个、桂皮1块、香叶5片、冰糖10 g、老姜5 g，煮沸5 min，冷却后，加入500 mL高粱酒、3%食盐。

1.2.2 一定浓度酵母菌、功能乳酸菌菌悬液的制备

用移液枪吸取200 μL冷冻功能乳酸菌、酵母菌菌体液分别加于MRS、YPD平板中，涂抹均匀。放入培养箱中培养，功能乳酸菌在37 ℃培养48 h，酵母菌在30 ℃培养24 h，从斜面培养基中，挑取单一菌落加入液体培养基中扩大培养，功能乳酸菌置于37 ℃、120 r/min摇床培养48 h，酵母菌置于30 ℃、120 r/min摇床培养24 h,取50 mL扩培后培养基于50 mL离心管中，2000 r/min离心15 min，得到菌泥，加入25 mL生理盐水洗涤，离心(2000 r/min， 15 min)，重复2～3次，得到菌泥，用灭菌生理盐水将其稀释至0.5 Abs(分光光度计，波长600 nm)。

1.2.3 单菌株发酵最佳产酸、产酯接种量的确定

将切片后的萝卜200 g加入密闭的发酵瓶中，并添加泡菜盐水450 mL，分别接种1%、3%、5%、7%、9%(菌液体积与萝卜质量，V/m)的0.5 OD值乳酸菌菌液(酵母菌液)到发酵瓶中[10]，两种菌株单独加入，每个梯度做3个平行试验，置于30 ℃恒温培养箱中发酵，每隔24 h检测泡菜中的乳酸和总酯含量变化，当乳酸和总酯不再改变时，即为发酵终点，确定最佳菌种接种量。

1.2.4 复配菌剂发酵泡菜最佳时间的确定

按上述步骤制作泡菜，接种最适浓度的乳酸菌和酵母菌，30 ℃恒温发酵，每隔24 h检测泡菜中乳酸、总酯的含量，当泡菜中乳酸、总酯的含量不再改变时，视为发酵终点，并记录时间[11]。

1.2.5 发酵温度对泡菜产酸产酯的影响

按上述步骤制作泡菜，接种最适浓度的乳酸菌和酵母菌，分别置于22，25，28，31，34，37 ℃ 6个发酵温度条件下，发酵7 d后，检测泡菜中乳酸和总酯的含量，并做感官评定，综合确定最佳发酵温度。每个温度条件做3组平行试验。

1.2.6 总酸、总酯的测定方法

总酸的检测参见国标GB/T 12456-2008[12]。

总酯的检测参见国标GB/T 10345-2007[13]。

1.2.7 感官评价标准

泡菜的感官评价标准表见表1。

表1 泡菜的感官评价标准表Table 1 The sensory evaluation standard table of pickles

2 结果与分析

2.1 功能乳酸菌接种量对泡菜发酵产酸的研究

由图1可知，泡菜中的乳酸含量比泡菜汁中的乳酸含量高，功能乳酸菌接种量为1%、3%(V/m)时，泡菜中乳酸的含量随着接种量增加而上升，乳酸含量分别为0.38，0.43 g/100 g；当接种量达到5%(V/m)时，此时乳酸菌的含量适当且浓度大，乳酸的积累快，乳酸含量高达0.52 g/100 g；当功能乳酸菌接种量为7%、9%(V/m)时，功能乳酸菌浓度已经饱和，乳酸含量不再增加。结合泡菜中乳酸含量变化可以确定，功能乳酸菌的最佳接种量是5%，产酸量最高可以达到0.52 g/100 g。

图1 不同功能乳酸菌接种量(V/m)条件下乳酸的含量Fig.1 The content of lactic acid under different functional lactic acid bacteria inoculation amount (V/m)

2.2 酵母菌接种量对泡菜发酵产酯的研究

酵母菌的主要功能是产酯，是形成泡菜特殊风味的主要物质，酵母菌接种量越大，产生的总酯含量越高，随着酵母菌的接种量达到饱和，单一地继续加大酵母菌的接种量不会再对泡菜中总酯的含量有所改变。由图2可知，酵母菌接种量为1%、3%(V/m)时，泡菜中总酯含量随着接种量的增加而上升；当接种量达到5%(V/m)时，酵母菌浓度已经饱和[14]，总酯的含量相对较高，达到1.27 g/100 g，继续加大酵母菌的接种量对于泡菜总酯含量不会再有影响。结合泡菜汁中的总酯含量变化可以确定酵母菌的最佳接种量为5%(V/m)，最大产酯可以达到1.27 g/100 g。

图2 不同酵母菌接种量(V/m)条件下泡菜汁中总酯的含量Fig.2 The content of total esters in pickle juice and picklesunder different yeast inoculation amount (V/m)

2.3 不同发酵时间对泡菜发酵产酸、产酯的研究

由图3可知，随着发酵时间的增长，泡菜中乳酸含量呈现先上升后平稳的趋势。发酵开始的1～3 d，功能乳酸菌含量较少，发酵缓慢，此时泡菜中乳酸含量为0.22 g/100 g，达到第4天，功能乳酸菌增加到一定数量，繁殖基数增大，产酸能力增强，随着时间的推移，乳酸逐渐积累，pH下降，功能乳酸菌成为优势菌种，抑制其他微生物的生长，继续产酸，到第7天时，泡菜中功能乳酸菌达到饱和，功能乳酸菌总量不再改变，乳酸含量不再上升，开始趋于稳定。所以功能乳酸菌的最佳发酵时间为7 d。发酵到第7天时，乳酸的最高产量可以达到0.61 g/100 g。

图3 不同发酵时间的泡菜汁和泡菜中的乳酸含量Fig.3 The content of total acids in pickle juice and pickles at different fermentation time

图4 不同发酵时间的泡菜汁和泡菜中的总酯含量Fig.4 The content of total esters in pickle juice and pickles at different fermentation time

由图4可知，随着发酵时间的增长，泡菜中总酯含量呈现先上升后平稳的趋势。发酵开始的1～3 d内，酵母菌大量繁殖，产生大量的总酯，此时泡菜中的总酯达0.68 g/100 g，这时酵母菌成为优势菌种，随着时间的推移，酵母菌的数量增多，乳酸积累，pH下降，使功能乳酸菌成为优势菌种，酵母菌生长变缓慢，增长速度上相比于之前有所放缓，总酯的总体含量仍在变化中，当发酵到第7天时，泡菜中的总酯达1.26 g/100 g，此时泡菜中酵母菌含量达到饱和，酵母菌不再生长繁殖，总酯含量也不再上升，趋于稳定，所以酵母菌的最佳发酵时间为7 d。发酵到第7天时，总酯的含量可以达到1.26 g/100 g。

2.4 不同发酵温度对泡菜产酸、产酯的影响

由图5和图6可知，在温度单因素实验中，从22 ℃开始，泡菜中乳酸、总酯的含量随着温度的上升而明显增加，说明随着温度的升高，功能乳酸菌和酵母菌的生长、发酵速度在加快；当温度达到28 ℃时，泡菜中乳酸、总酯含量最大，乳酸含量为0.56 g/100 g，总酯含量为1.76 g/100 g；当温度超过28 ℃后，乳酸、总酯的含量开始下降。结合之前功能乳酸菌接种量、酵母菌接种量、发酵时间的单因素实验，可以判断泡菜发酵温度在28 ℃时最佳。泡菜中总酯的最高产量可以达到1.76 g/100 g，乳酸的最高产量可以达到0.56 g/100 g。

图5 不同发酵温度条件下乳酸的含量Fig.5 The content of lactic acid at different fermentation temperatures

图6 不同发酵温度条件下总酯的含量Fig.6 The content of total esters at different fermentation temperatures

2.5 最适发酵条件下泡菜的感官评价得分

由表2可知，在泡菜发酵过程中添加5%(V/m)、OD值为0.5的功能乳酸菌和酵母菌菌悬液，在28 ℃条件发酵7 d后，得到的泡菜色泽鲜艳、香味浓郁、味道咸酸、酸度适中、口感脆嫩。

表2 泡菜感官评价表Table 2 The sensory evaluation of pickles

续 表

3 结论

本研究通过接种不同浓度梯度的功能乳酸菌、酵母菌，研究泡菜发酵过程中乳酸、总酯的含量及其变化情况，并在最适接种量下，探究功能乳酸菌、酵母菌的最适产酸、产酯温度。结果表明，在泡菜发酵过程中功能乳酸菌、酵母菌的最佳接种量为5%(V/m)，OD值为0.5，最佳发酵温度为28 ℃，发酵7 d。此时泡菜中的乳酸和总酯含量最高，乳酸的含量最高可达0.56 g/100 g，总酯的含量最高可达1.76 g/100 g。此研究为提升泡菜品质，缩短泡菜发酵周期，促进泡菜工业化、标准化纯种发酵生产奠定了基础。