生料醋醅中巴氏醋杆菌的发酵条件优化及有机酸分析

李阳，张丽珍*，甄晓君，柳青山，张一中

(1.山西大学 生命科学学院，太原 030006；2.山西圣堂食品科技有限公司，山西 长治 047500；3.山西省农业科学院高粱研究所，山西 晋中 030600)

食醋在我国有着悠久的酿造历史[1]，口感绵香，营养丰富[2]，更有杀菌、降血压等功效[3-4]，是一种畅销的酸味调味料。食醋种类繁多，口味独特，深受消费者喜欢[5]。传统食醋的酿造方法是将粮食蒸煮后，加入大曲进行发酵[6]，最先出现于山西省长治市的生料醋，与传统醋的主要区别是原料不需蒸煮，直接加入发酵剂进行发酵[7]，微生物种类更多，口感也更加醇和，因其可节省大量的劳动力与蒸煮设备，现已被越来越多的酿醋工厂关注。

目前多数发酵工艺的优化集中在果醋酿造[8-10]，对生料醋的研究局限于发展前景[11]、真菌多样性的分析[12]。巴氏醋杆菌是食醋发酵过程中一种重要的醋酸菌，多数学者主要围绕菌株的发酵生长[13-14]，对酸、醇的耐受情况展开探究[15]，针对生料醋醅中巴氏醋杆菌的发酵优化未见报道。已有研究结果得出，从生料醋醅中筛选出5株醋酸菌经生物学鉴定均为巴氏醋杆菌，但其发酵性能各有不同，因此研究生料醋醅中巴氏醋杆菌的发酵特性，对于深入了解生料酿醋与熟料酿醋在发酵上的差异具有指导意义。有机酸是评价食醋风味的重要指标[16]，决定了食醋的品质和感官特性[17]，利用高效液相色谱法对有机酸进行检测也尤为重要[18]。本文以生料醋醅中筛选出的巴氏醋杆菌L3为菌种，通过响应面法优化其发酵条件，分析发酵液中有机酸的组成与含量，为生料醋酿造工艺的改进及品质把控提供了数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

巴氏醋杆菌L3：从山西长治某醋厂生料醋醅中分离获得，鉴定为巴氏醋杆菌后编号L3于-80 ℃超低温冰箱中保藏备用；无水葡萄糖：山东西亚化学工业有限公司；硫酸镁：天津市北辰方正试剂厂；酵母粉、蛋白胨：北京奥博星生物技术有限责任公司；无水乙醇(分析纯)：天津欧博凯化工有限公司；磷酸二氢钾、甲醇、乳酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、草酸(色谱纯，纯度>99%)：Aladdin公司。

AD-88大容量全温气浴振荡器 常州国宇仪器制造有限公司；YXQ-LS-50S Ⅱ立式压力蒸汽灭菌器 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；ME204电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；PHS-3C型pH计 雷磁仪器厂；Agilent 1260 Infinity II液相色谱仪 费尔伯恩精密仪器(上海)有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 培养基的配制

发酵培养基：葡萄糖10 g，酵母粉10 g，硫酸镁0.5 g，磷酸二氢钾0.5 g，水1000 mL，于0.1 MPa、121 ℃灭菌27 min。使用前加入4%无水乙醇。

1.2.2 醋酸菌的活化

将保存于-80 ℃超低温冰箱中的巴氏醋杆菌L3解冻后接入发酵培养基，在28 ℃、180 r/min的全温气浴振荡器中振荡培养24 h，然后从该发酵培养基中以2%的接种量接种于新的培养基培养24 h，活化完成。菌液按不同的接种量接种于后续试验的发酵培养基中。

1.2.3 单因素试验设计

1.2.3.1 初始乙酸量对生料醋醅中巴氏醋杆菌发酵条件的影响

影响醋酸菌发酵的因素有通氧量、温度、初始乙酸量、初始乙醇量、醋酸菌接种量等，由于通氧量、温度试验对振荡培养箱数量要求较高，结合自身实验室所具备的试验条件，选择初始乙酸量、初始乙醇量、醋酸菌接种量3个试验因素研究对生料醋醅中巴氏醋杆菌发酵条件的影响。已通过预试验得出巴氏醋杆菌在发酵第5天时总酸含量达到最高，为保证数据的准确性，试验将巴氏醋杆菌在37 ℃下培养9 d，每天取样检测发酵液中总酸含量，以期确定合适的发酵条件，进一步优化巴氏醋杆菌的发酵。

在装液量为25 mL/100 mL，接种量为2%，初始乙醇量为4%，于37 ℃、180 r/min振荡培养9 d的条件下，考察初始乙酸量0.5%、1%、1.5%、2%、3%对生料醋醅中巴氏醋杆菌发酵的影响。

1.2.3.2 初始乙醇量对生料醋醅中巴氏醋杆菌发酵条件的影响

在装液量为25 mL/100 mL，接种量2%，初始乙酸量为2%，于37 ℃、180 r/min振荡培养9 d的条件下，考察初始乙醇量2%、3%、4%、6%、8%对生料醋醅中巴氏醋杆菌发酵的影响。

1.2.3.3 接种量对生料醋醅中巴氏醋杆菌发酵条件的影响

在装液量为25 mL/100 mL，初始乙酸量为2%，初始乙醇量为4%，于37 ℃、180 r/min振荡培养9 d的条件下，考察接种量2%、3%、4%、5%、6%对生料醋醅中巴氏醋杆菌发酵的影响。

1.2.4 响应面法优化试验的设计

在单因素试验的基础上，根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，以37 ℃发酵5 d的总酸(g/L)为响应值，选择初始乙酸量(%)、初始乙醇量(%)、醋酸菌接种量(%)进行三因素三水平响应面分析试验，确定最优发酵条件[19-20]。因素和水平编码见表1。

表1 响应面试验因素水平方案设计表Table 1 The factors and levels of Box-Behnken experiment design

1.2.5 优化前后发酵液中有机酸的测定

优化发酵条件前，巴氏醋杆菌的发酵条件为初始乙酸量0%、初始乙醇量4%、醋酸菌接种量2%、温度37 ℃。为了更深入地了解发酵条件对巴氏醋杆菌发酵的影响，将发酵条件未优化和已优化的发酵液在37 ℃下各培养5 d，检测优化前和优化后两种发酵液中有机酸的种类和含量，考察发酵条件对有机酸生成的影响。

1.2.6 测定指标1.2.6.1 总酸的测定

总酸(以醋酸计，g/L)的测定参照GB/T 5009.41-2003《食醋卫生标准的分析方法》。

1.2.6.2 有机酸的测定

产酸高效液相色谱检测条件参照杨钰昆等的测定方法[21]。色谱柱：Supersil AQ-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇∶0.02 mol/L磷酸二氢钾体积比为3∶97(磷酸调pH至2.7)；流速：1.00 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：210 nm；进样量：10 μL。

有机酸混标液：分别称取草酸、乳酸、乙酸各0.01 g，柠檬酸、琥珀酸各0.02 g，定容至10 mL，于4 ℃冰箱中保存备用。以不同的进样浓度为横坐标，对应不同的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程和相关系数。

1.3 数据处理

试验均重复3次，结果取平均值。利用SPSS 20和Excel 2003分析数据并制作图表，Design-Expert V8.0.6设计响应面试验方案及数据的处理。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 初始乙酸量对总酸含量的影响

图1 初始乙酸量对总酸的影响Fig.1 Effect of initial acetic acid amount on total acid content

由图1可知，总酸呈现先增加后趋于稳定的趋势，发酵液总酸在发酵5 d后趋于稳定。乙酸添加量从0.5%增加到1.5%时，总酸含量明显增加；添加量为2%时，总酸含量在第5天达到最大，为47.22 g/L；当乙酸添加量超过2%，总酸量开始降低。添加适量的乙酸会促进乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的生成[22]，适当的酸性环境也有利于醋酸菌的生长，乙酸含量过高，酸度过高，反而抑制了醋酸菌的活性。

2.1.2 初始乙醇量对总酸含量的影响

图2 初始乙醇量对总酸的影响Fig.2 Effect of initial ethanol amount on total acid content

由图2可知，醋酸菌有较好的乙醇耐受性，在发酵5 d时，发酵液中总酸达到最大，随着发酵时间的延长，总酸在第9天略微降低，可能是发酵后期碳源供应不足，发生了过氧化乙酸的现象[23]。乙醇作为醋酸菌的直接碳源，含量过低时(2%)不能满足菌株对碳源的需求，过高时则会抑制菌株的发酵[24]，因此不适当的乙醇含量都不利于其生长。初始乙醇量为4%时总酸含量在发酵第5天达到最高，为47.40 g/L。

2.1.3 醋酸菌接种量对总酸含量的影响

图3 醋酸菌接种量对总酸的影响Fig.3 Effect of acetic acid bacteria inoculation amount on total acid content

在发酵过程中，醋酸菌的主要作用是氧化乙醇生成醋酸，接种量的多少直接影响到最终的产酸量[25]。由图3可知，发酵5 d左右产酸量达到最大且基本稳定。接种量过低，酒精不能发酵完全，过高时发酵液中营养物质不能满足大量菌体的生长，醋酸菌会出现自溶和提前老化等现象，产酸量也相对较低[26]。综合可知接种量为4%时醋酸菌产酸最高，在发酵第5天时达到最高，为47.64 g/L。

2.2 巴氏醋杆菌发酵条件的优化

2.2.1 二次回归方程的建立与方差分析

根据单因素的试验结果，得出X1(初始乙酸量)2%、X2(初始乙醇量)4%、X3(醋酸菌接种量)4%，发酵5 d时，总酸最高。利用Design-Expert V8.0.6软件以发酵5 d的总酸为响应值，设计三因素三水平共17组(5个中心点)的响应面试验，设计方案及结果见表2。

表2 响应面分析试验设计及结果Table 2 Design and test results of response surface analysis

对表2的结果进行回归分析，得到总酸对初始乙酸量、初始乙醇量、接种量的二次回归方程：Y=46.41+2.66X1+5.27X2+0.9X3-3.89X1X2-1.25X1X3-0.092X2X3-2.15X12-5.73X22-2.09X32。

对该回归模型进行方差分析，结果见表3。

表3 响应面试验结果方差分析Table 3 Analysis of variance (ANOVA) for response surface model

由表3可知，该模型的F值为100.06，P<0.0001，说明该模型为极显著水平，模型成立。决定系数R2为0.9923，P失拟项为0.0547>0.05，F失拟项为6.23，表明该模型拟合良好，未知因素干扰较小，回归方程合理可信，适用于巴氏醋杆菌发酵条件的优化。一次项X1、X2，交互项X1X2，二次项X12、X22、X32对总酸的影响极显著(P<0.01)；一次项X3，交互项X1X3对总酸的影响显著(P<0.05)；X2X3的影响不显著。根据各因素的F值大小可以得出：初始乙醇量对发酵液中总酸的影响最大，初始乙酸量次之，接种量的影响最小。

2.2.2 发酵条件的响应面分析及优化

根据响应面法所得的图形是指特定的响应值总酸(Y)与相对应的因素X1、X2、X3构成的3D立体图，将一个因素固定为零水平，分析另外两因素的相互作用，由图4可知各因素交互作用的显著性[27]，通过分析等高线图可得出最优条件下的取值范围。初始乙酸量、初始乙醇量、醋酸菌接种量3个因素两两交互对巴氏醋杆菌总酸的影响结果见图4。

图4 响应面分析因素间交互作用对总酸的影响Fig.4 Response surface analysis of the effect of interactions among independent variables on total acid content

图5 实际值与预测值的拟合性Fig.5 The fitting of actual values and predicted values

由初始乙酸量和初始乙醇量的响应面图(见图4中a)可知，响应曲面陡峭，等高线呈椭圆形，说明这两个因素的交互作用对总酸的影响极显著(P<0.01)。由初始乙醇量和醋酸菌接种量的响应面图(见图4中b)可知，响应曲面呈抛物线形，等高线密集，说明这一组合对总酸的影响显著(P<0.05)。由初始乙酸量和醋酸菌接种量的响应面图(见图4中c)可知，响应曲面坡度降低，等高线密集度也降低，说明总酸受到初始乙酸量和醋酸菌接种量的交互影响，但趋势降低。该结论与表3的方差分析结果一致。由图5可知，实际值和预测值的拟合度较高，证明此次试验结果真实可靠。

2.2.3 验证试验

为验证响应面的分析结果，对上述回归方程进行分析，得到最优发酵条件为初始乙酸量2.12%，初始乙醇量4.38%，醋酸菌接种量4.14%，此条件下总酸可达49.78 g/L，考虑实际试验操作的可行性，将条件调整为初始乙酸量2%，初始乙醇量4.5%，醋酸菌接种量4%，3次平行试验后得到总酸的平均值为48.65 g/L，与理论值误差不超过5%，证明该模型能够较好地优化生料醋醅中巴氏醋杆菌的发酵条件，该方法实用可靠。

2.3 有机酸的检测

2.3.1 有机酸标样的色谱图

草酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸5种有机酸标准品混合溶液的液相色谱图见图6。

图6 有机酸混合标准溶液色谱图Fig.6 Chromatogram of organic acid mixed standard solution

由图6可知，5种有机酸在10 min内完全分离，且峰形较好。

对发酵液中的有机酸进行液相色谱分析，见图7。朱其瀚[28]从镇江香醋醋醅中筛选出一株巴氏醋杆菌，经测定可产乳酸、乙酸、酒石酸3种有机酸，相比之下，生料醋中有机酸的种类更丰富，因此口感更为独特。

图7 发酵液有机酸色谱图Fig.7 Chromatogram of organic acids in fermentation broth

2.3.2 线性关系和相关系数

按照1.2.6所述方法对5种标准有机酸进行线性回归分析，见表4。所得标准曲线的相关系数均大于0.998，表明线性关系良好，该方法可以用于5种有机酸的测定。

表4 有机酸的回归方程、相关系数Table 4 The regression equations and correlation coefficients

2.3.3 有机酸的分析结果

对发酵条件进行优化后，检测发酵第5天的有机酸种类与含量，与优化前(发酵温度37 ℃，初始乙酸量0%，初始乙醇量4%，醋酸菌接种量2%)的检测结果进行对比，结果见表5。

表5 发酵液中有机酸种类与含量Table 5 The types and content of organic acids in fermentation broth

由表5可知，优化后含量显著增加的有机酸为乙酸，与优化前相比增加了29.65 g/L，是食醋中的主要呈味物质，乳酸产量也略有增加，由1.75 g/L增加到2.80 g/L，草酸、柠檬酸、琥珀酸产量没有明显变化，分别是0.08，0.17，0.47 g/L，这4类难挥发的有机酸可减轻乙酸的刺激性口感[29]，与乙酸共同构成了食醋酸爽醇香的风味特征。

3 结论

本试验以生料醋醅中获得的巴氏醋杆菌为研究对象，在单因素试验的基础上，运用响应面法对其发酵工艺进行优化，经分析得到最优发酵条件为：初始乙酸量2%，初始乙醇量4.5%，醋酸菌接种量4%，此条件下总酸可达48.65 g/L。对此条件下的有机酸进行检测，分析了乙酸、草酸、乳酸、柠檬酸、琥珀酸5种有机酸，与优化前有显著差异的为乙酸，优化后可达37.60 g/L，其余质量浓度分别是0.08，2.80，0.17，0.47 g/L，这些有机酸中和了乙酸的刺激感，使食醋的口感更加柔和。