姜黄素诱导人肝癌BEL-7404细胞凋亡的内质网应激作用的研究

张美兰，沈哲式，张英哲，金雪梅，韩龙哲，金仁顺 (延边大学附属医院病理科，吉林 延吉 133000)

内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ERS)是细胞凋亡的一条途径，早期ERS发挥细胞保护作用，但持续的ERS使细胞凋亡信号通路被激活，以保护细胞的功能稳定[1]。

姜黄素(curcumin)是一种从中药姜黄(Curcuma longa L.)根茎中提取出来的脂溶性多酚类化合物，在抗肿瘤作用方面体现了良好的药效。研究表明，姜黄素结合甘草次酸可以抑制人肝癌HepG-2增殖与分化，且其抗肿瘤作用机制与抑制肿瘤血管生成、抑制肿瘤细胞增殖与分化、诱导肿瘤细胞凋亡密切相关[2-3]。本实验探究姜黄素对人肝癌BEL-7404细胞凋亡的ERS作用机制，为姜黄素的开发利用提供实验依据。

1 材料与仪器

1.1材料：人肝癌BEL-7404细胞购于南京凯基生物制品有限公司；姜黄素购于MCE公司；Hoechst33258染色液、Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购于碧云天生物技术有限公司；小牛血清和青链霉素购于美国Gibco公司；DMEM培养液和胰酶购于Invitorgen公司；SDS-PAGE凝胶试剂盒购于索莱宝科技有限公司；PVDF膜、ECL检测显影液购于Merck Millipore公司；GRP78、p-elF2α、p-JNK、CHOP抗体购于CST公司；Caspase-4抗体购于Abcam公司；羊抗兔IgG购于中杉金桥生物技术有限公司；MTT粉购于美国Sigma公司。

1.2仪器：超净工作台(C1109C)、CO2培养箱(COR-1150) (上海智城分析仪制造有限公司)；电泳仪(DYY-7C)、转膜仪(DYCZ-40D) (北京市六一仪器厂产品)；UPV凝胶成像仪(Biospectrum,美国UVP凝胶成像系统有限公司)；酶标仪(日本TECAN公司)；倒置显微镜 (日本Olympus公司)。

2 方法

2.1细胞培养及分组：人肝癌BEL-7404细胞培养于含10%小牛血清的DMEM中，37℃、5%CO2恒温全湿培养箱中进行培养。每48小时换液传代，取生长良好、处于对数生长期的细胞进行实验。细胞分为空白对照组(vehicle)、姜黄素组(20、40、60 μmol/L )。

2.2MTT法检测细胞增殖：收集对数生长期的人肝癌BEL-7404细胞，制成细胞悬液，将细胞按照每孔1×104个接种于96孔板中，每孔细胞悬液200 μl。24 h 后弃去原孔内的培养液，分别加入含有不同浓度姜黄素(20、40、60 μmol/L) 的培养液培养24 h、48 h、72 h后，每孔加入浓度为5 g/L的MTT 20 μl，继续培养4 h后取出，弃其上清留底部沉淀，每孔再加入150 μl DMSO，避光放置于酶标仪内，在波长490 nm 处测定吸光度值，计算IC50和细胞存活率。计算公式如下：

2.3Hoechst染色检测细胞凋亡：将细胞制成细胞悬液，调整细胞浓度为1×106个每孔至含有爬片的6孔板中，培养24 h后，分别加入4 ml含有不同浓度姜黄素(20、40、60 μmol/L)的培养液培养。48 h后弃6孔板中培养液，95%乙醇固定细胞20 min，弃固定液，加入Hochest染料避光染色8 min左右，将其置于荧光显微镜下(400×)观察，选取适当视野进行拍照。

2.4流式细胞仪检测细胞凋亡率(Annexin V-FITC/PI 双染)：取不同浓度姜黄素组(20、40、60 μmol/L )和DMEM对照组细胞培养。48 h后，用不含EDTA的胰酶消化细胞，冰PBS终止消化，1 000 g离心4 min，再次清洗离心，弃上清，PBS制成细胞悬液，取各实验组细胞约5×104个，1 000 g离心4 min，弃上清，用195 μl Annexin V-FITC结合液制得细胞重悬液，加入5 μl Annexin V-FITC，室温避光孵育10 min，再加入10 μl PI，避光孵育5 min，上机检测，FACS Diva 4.1软件分析结果。

2.5免疫蛋白印迹检测蛋白的表达：各实验组细胞培养48 h后，提取细胞全蛋白，BCA试剂盒测定蛋白含量，配置凝胶。根据蛋白浓度计算上样量上样，电泳(100 V, 150 min)，转膜(100 V, 30～80 min)。室温下，5%脱脂奶粉封闭PVDF膜1 h。分别加入一抗(GRP78、p-elF2α、p-JNK、CHOP、Caspase-4) 室温孵育1.5～2 h，TBST清洗PVDF膜，放入二抗室温孵育1～1.5 h。ECL试剂盒显影，使用G:BOX chemiXR5成像系统显影，分析数据使用Image J 软件进行灰度分析。

3 结果

3.1姜黄素对人肝癌BEL-7404细胞增殖的作用:MTT结果显示，在不同浓度姜黄素(20、40、60 μmol/L)作用下，BEL-7404细胞的生存率明显下降，且呈一定的浓度和时间依赖性。姜黄素作用于细胞24 h时，IC50值为40.15 μmol/L。见图1。

与空白对照组比较，**P<0.01

3.2姜黄素对人肝癌BEL-7404细胞的内质网应激蛋白及凋亡蛋白表达的作用:Western blot结果显示，随着药物浓度的增加，与对照组相比，姜黄素组GRP78、p-elF2α、p-JNK、CHOP、Caspase-4表达量上升。40 μmol/L、60 μmol/L姜黄素组与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)。见图2。

与空白对照组比较，*P<0.05, **P<0.01

3.3姜黄素对人肝癌BEL-7404细胞凋亡的作用:Hoechst染色检测发现，随着姜黄素组浓度的增加，人肝癌BEL-7404细胞数量减少，蓝白荧光深染，出现明显细胞凋亡形态。流式细胞术结果显示，随着姜黄素浓度的增加，细胞凋亡率逐渐上升，20 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L姜黄素组与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)。见图3。

与空白对照组比较，**P<0.01

4 讨论

肝细胞癌 (HCC) 是世界五大最常见恶性肿瘤之一，占我国癌症发病率第2位和病死率的第1位[4]，严重威胁人类健康。姜黄素是姜黄的活性成分，具有多项生物活性，尽管其生物利用度较低，但其对肝的保护作用已在各种肝毒性方案中得到证实。已有研究表明姜黄素可改善小鼠肝损伤[5]，姜黄素半乳糖化BSA纳米粒可作为靶向药物载体抑制肝癌细胞的增殖和迁移[6]，可见姜黄素具有较好的肝细胞保护作用及抗肿瘤活性。本实验研究发现，姜黄素作用于人肝癌BEL-7404细胞后，随着药物浓度的增加BEL-7404细胞存活率逐渐下降，凋亡率逐渐上升，证实姜黄素对BEL-7404细胞具有生长抑制作用及促凋亡作用。

ERS是细胞发生凋亡的一条重要通路，其过程需要多种分子伴侣及特异性蛋白参与，主要包括CHOP的转录激活、JNK途径、Caspase-12活化及Ca2+通路等[7]。本研究测定了姜黄素诱导BEL-7404细胞凋亡的作用机制，发现随着药物浓度的增加，GRP78、p-elF2α、p-JNK、CHOP、Caspase-4蛋白表达量也逐渐上升，说明姜黄素诱导的BEL-7404细胞凋亡与激活ERS密切相关。

通过本研究证实，姜黄素可通过激活内质网应激作用诱导人肝癌BEL-7404细胞发生凋亡。今后将进一步开展动物体内实验，深入探究其作用机制，为姜黄素的开发和利用提供可靠的实验依据。