基于iTRAQ 技术分析牛初乳与常乳乳清差异蛋白质组

邓 微，李韫同，李墨翰，曹雪妍，郑 艳，武俊瑞，岳喜庆，杨 梅

（沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳 110866）

牛乳中含有丰富的营养物质，包括人体所需的蛋白质、脂肪、乳糖、矿物质等成分，是人类膳食中非常重要的部分。牛乳除了能够为人体提供足够的营养成分，还会供给生物活性物质，这些生物活性物质具有提高人体免疫力、调节胃肠道健康以及抵抗病毒等作用[1]。牛初乳中含有丰富的免疫活性物质以及非特异性抗菌物质，对新生儿至关重要，能够为其提供抵抗感染的防御能力[2-3]、促进胃肠道组织生长发育以及存进机体功能成熟[4]的作用，具有“免疫之王”和“乳黄金”之称。

蛋白质是牛乳中最主要的成分之一，大约占牛乳的3.5%，而乳脂肪球膜蛋白、酪蛋白、乳清蛋白是牛乳蛋白的主要成分，其中乳清蛋白占牛乳总蛋白的20%左右。乳清蛋白具有较高的营养价值，相对于酪蛋白，乳清蛋白更容易被人体消化吸收，是人体所需的优质蛋白质补充剂[5-6]。乳清蛋白含有丰富的免疫球蛋白、乳铁蛋白以及一些小分子活性肽，因此被广泛应用在婴幼儿乳制品、功能性食品以及特需食品中[7-10]。近年来关于牛乳乳清蛋白的研究更是越来越多，研究者们利用先进的蛋白质组学技术，阐明了不同乳源乳清蛋白质组成，并找到了差异表达蛋白[11-13]。对于乳制品工业而言，牛乳产量大、应用广，是目前生产乳制品最主要的原料之一，因此发现其中重要的功能活性成分，并应用到乳制品中，具有重要意义。近年来，随着科学技术的不断发展，大规模的蛋白质定量技术不断应用在乳制品中，并得了一些进展[14-18]，然而，大规模的不同泌乳期牛乳的定量蛋白质组学研究还鲜有报道。

本研究利用同位素标记相对和绝对定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）蛋白质组学技术，探究了牛初乳与牛常乳乳清蛋白丰度差异，利用生物信息学方法，分析了牛初乳与牛常乳乳清丰度差异蛋白的功能，为生产和提高牛乳产品品质、研发婴幼儿乳粉及功能性食品的生产提供重要信息和参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牛乳来自于沈阳辉山乳业牧场，为了确保实验的准确性，样品选自年龄均为1～3 岁之间健康的黑白花奶牛，饲养与管理条件均一致。初乳（0～3 d）、常乳（1～6 个月）的样品各采集自60 头奶牛。采集后的样品立即放入冰盒中运送至实验室，并在超低温冰箱中-80 ℃贮藏备用。实验前，将牛初乳与牛常乳分别混合，其目的为排除个体性差异。

二硫苏糖醇（dithiotheritol，DTT）、十二烷基硫酸钠、尿素、三羟甲基氨基甲烷（tris(hydroxymethyl)methyl aminomethane，Tris） 美国Bio-Rad公司；测序级胰蛋白酶、iTRAQ 8标试剂盒、Bradford蛋白定量试剂盒、色谱级甲酸、色谱级乙腈、30 kDa超滤离心管 美国Sigma公司；C18固相萃取小柱美国Waters公司；盐酸、氯化钙、氯化钠（均为分析纯）国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

Q-Exactive高分辨质谱仪 美国Thermo Fisher公司；微量移液器、真空离心浓缩仪、5910R低温高速离心机 德国Eppendorf公司；AKTA Purifier 100纯化仪美国GE Healthcare公司；WFZ UV-2100可见-紫外分光光度计 美国尤尼柯公司；Milli-Q超纯水系统 赛多利斯集团公司；真空冷冻干燥机 磐丰干燥设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牛乳乳清蛋白的制备

样品于-80 ℃冰箱取出，4 ℃溶解。各取50 mL样品于离心管中，在4 ℃、8 000×g离心20 min。小心移去上次乳脂肪，剩余的脱脂乳置于新的离心管中，加入10 mL的PBS清洗3 次，每次超声1 次（60 W，20 s），4 ℃、80 000×g离心60 min，收集下层脱脂乳样品。中层和下层样品继续4 ℃、120 000×g离心60 min，收集上清乳清样品。加入5 倍体积的预冷丙酮，充分溶解，-18 ℃冷却过夜。并于4 ℃、100 000×g离心20 min，收集蛋白质沉淀，此步骤重复3 次，得到乳清蛋白，利用Bradford试剂盒测定乳清蛋白含量[19]。

1.3.2 牛乳乳清蛋白的胰蛋白酶酶解及iTRAQ标记

根据牛乳乳清蛋白质浓度测定结果，分别取样品（牛初乳、牛常乳）提取的乳清蛋白500 μg，向样品中加入一定量的缓冲液A（0.1 mol/L NH4HCO3、pH 8.0 0.1 mol/L Tris-HCl、8 mol/L尿素），加入DTT将终浓度调整为10 mmol/L，并与37 ℃条件下，孵育120 min，反应结束后冷却至室温。向混合溶液中加入IAA调整浓度为50 mmol/L，避光反应45 min。加入一定量的水，将B缓冲液A的浓度稀释至1.5 mol/L，按照1∶50的比例添加测序级胰蛋白酶，并于37 ℃条件下反应20 h，最终牛乳乳清蛋白酶解液利用C18进行脱盐处理，并与OD280nm肽段进行定量[20]。取200 μg的乳清蛋白酶解肽段，利用iTRAQ试剂盒进行标记，标记后的肽段在室温下孵育60 min。

1.3.3 毛细管高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）测定

每份样品采用nL流速HPLC液相系统进行牛乳乳清蛋白肽段分离。缓冲液：A液选择0.1%甲酸溶液，B 液选择0.1%甲酸-乙腈溶液（乙腈的质量分数为84%）。色谱柱以95%的A液平衡。样品由自动进样器上样到C18（2 cm×100 μm，5 μm），再经分析柱C18（75 μm×100 mm，3 μm）分离，流速控制为300 nL/min。梯度洗脱程序：0～50 min，96%～50% A，4%～50% B；50～54 min，50%～0% A，50%～100% B；54～60 min，0% A，100% B。

每份牛乳乳清蛋白标记肽样品经毛细管HPLC分离后利用Q-Exactive质谱仪进行质谱分析。分析时长为60 min，利用+离子检测，母离子扫描范围控制在m/z300～1 800。质谱分析原始数据存为RAW文件，用软件Mascot 2.2结合Proteome Discoverer 1.4进行查库鉴定及牛乳乳清蛋白酶解肽段定量分析。原始文件用Proteomics Tools分析软件抽提肽段报告离子峰定量信息，并以牛初乳组为内参对信号强度进行归一化分析处理，以软件计算的各肽段比值的加权平均值作为蛋白质定量结果。查库时将储存的RAW文件利用Proteome Discoverer软件提交至Mascot 2.2服务器，选择已经建立好的数据库，然后进行数据库搜索。利用Proteome Discoverer 1.4软件对牛乳乳清蛋白酶解肽段报告离子峰的强度值进行定量分析[21]。

1.4 牛乳乳清蛋白的生物信息学分析

为确定蛋白的功能，利用在线DAVID在线数据分析软件进行蛋白数据库检索（https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp），分析乳清丰度差异蛋白的基因功能注释（gene ontology，GO）和关键词。利用STRING分析软件（https://string-db.org/）探究不同泌乳期牛乳乳清丰度差异蛋白之间的互作网络。

2 结果与分析

2.1 牛乳乳清质谱鉴定

将iTRAQ标记后牛初乳、牛常乳乳清蛋白酶解混合肽段进行强阳离子柱分离，为保证鉴定蛋白数量，采用分级的方式进行收集肽段，结果如图1所示。

图1 牛乳乳清蛋白酶解肽段SCX色谱图Fig. 1 SCX chromatogram of peptides derived from enzymatic hydrolysis of milk whey proteins

牛乳乳清蛋白酶解肽段利用SCX分级并进行脱盐后的样品利用质谱分析，然后数据利用Mascot查库。结果合并后根据Peptide FDR≤0.01进行筛选过滤。最终鉴定到2 810 个肽段，通过对比数据库，在不同泌乳期牛乳乳清中共鉴定到599 种蛋白，其中在牛初乳与牛常乳中找到60 种乳清丰度差异蛋白（P＜0.05），如图2所示。虽然牛常乳与牛常乳乳清蛋白具有一定的相似性，但是在丰度上存在一定的差异。Golinelli等[22]利用2-DE在初乳中鉴定到20 个点，在牛常乳中鉴定到18 个点。Yang Mei等[23]利用iTRAQ研究了人乳与牛乳差异表达乳清蛋白，并找到了乳清蛋白的功能差异。Senda等[24]利用2-DE技术在牛乳乳清中鉴定到25 种蛋白。Yang Yongxin等[25]利用iTRAQ标记的方法在人常乳与牛常乳中鉴定到了211 种乳清蛋白，并找到了133 种差异表达蛋白。Le等[26]利用蛋白质组学技术在牛初乳乳清中鉴定到253 种蛋白，在牛常乳乳清中鉴定到257 种蛋白。对比之前的研究，本实验鉴定到了更多的牛乳乳清蛋白并获得了更多的定量信息，这些蛋白可能是牛乳乳清中重要的生物活性成分。

图2 牛初乳与常乳乳清差异表达蛋白热图Fig. 2 Hierarchical clustering heat map of differentially expressed whey proteins between bovine colostrum and mature milk

在这些丰度差异蛋白中，与牛常乳相比，在牛初乳中存在25 种上调表达蛋白，35 种下调表达蛋白。这些不同泌乳期牛乳乳清差异蛋白中，糖基化依赖性细胞黏附分子1（登录号：P80195）、α-乳白蛋白（登录号：Q9TSR4）、乳过氧化物酶（登录号：A5JUY8）、蛋白激酶c结合蛋白NELL2（登录号：H0YI34）、基质依赖磷酸盐运输蛋白2B（登录号：F1N6D4）在牛常乳中均表现出高表达水平（牛常乳乳清蛋白表达量均大于牛初乳乳清蛋白的5 倍以上）。这些高丰度的牛常乳乳清蛋白的发现能够为以牛乳清蛋白为基料生产功能性食品及特需食品提供理论依据。免疫球蛋白IgG轻链（登录号：Q6GMX4）、MHC I类抗原（登录号：Q860J9）、Ig重链的可变区（登录号：A2P2H9）、肌萎缩蛋白1（登录号：A0A024R2W4）、Igλ-1 C链（登录号：L8IAF4）在牛初乳乳清蛋白中均表现出高表达水平（牛初乳乳清蛋白表达量均大于牛常乳乳清蛋白的5 倍以上）。这些牛初乳乳清高表达量蛋白主要是与免疫相关的蛋白。牛初乳中高表达量蛋白的发现能够为婴幼儿配方乳粉的生产以及功能性食品提供重要信息。

2.2 乳清丰度差异蛋白的GO功能注释分析

GO功能注释包括生物过程、分子功能及分子组成。本研究将牛初乳与牛常乳乳清丰度差异蛋白进行GO功能注释进行分析，结果如图3所示。

图3 牛初乳与牛常乳乳清差异表达蛋白的GO功能注释Fig. 3 GO annotation of differentially expressed whey proteins between bovine colostrum and mature milk

通过牛初乳与牛常乳乳清丰度差异蛋白的GO功能注释分析可知，乳清差异蛋白主要参与的生物过程为转运、定位、单一生物作用、生物质量调节、以及纸质转运与定位；主要参与的分子功能为顶端质膜、细胞外区域、细胞外区域部分、细胞外区域空间以及膜结合细胞器；主要参与的细胞组成为蛋白结合和阴离子结合。将差异蛋白通过GO功能注释能够进一步了解这些差异蛋白的功能作用。牛初乳与牛常乳乳清差异蛋白在机体中丰度的上调与下调均会影响到一些生物调控作用。Liao等[27]利用GO功能注释分析了不同泌乳期人乳乳清差异蛋白主要参与了信号传导、细胞外组成、代谢等过程。Yang Yongxin等[28]利用iTRAQ技术分析了不同物种牛乳、骆驼乳、羊乳、水牛乳的乳清差异蛋白，并将差异蛋白利用GO功能注释进行分析，结果发现，不同哺乳动物乳乳清丰度差异蛋白主要参与的生物过程为生物调节；主要参与的分子功能为蛋白结合；参与细胞组成为细胞内部分。因此，找到这些差异表达蛋白对深入认识牛初乳与牛常乳乳清蛋白具有重要作用，为日后生产特定功能的乳清蛋白制品提供重要理论依据。

2.3 乳清丰度差异蛋白分析

图4 牛初乳与牛常乳乳清蛋白关键词Fig. 4 Key words about bovine whey proteins in bovine colostrum and mature milk

表1 牛初乳与牛常乳乳清与信号传导相关的丰度差异蛋白Table 1 Signal transduction-related differential abundant whey proteins between bovine colostrum and mature milk

表2 牛初乳与牛常乳乳清糖基化丰度差异蛋白Table 2 Differential abundant glycoproteins between bovine colostrum and mature milk

由图4可知，牛初乳与牛常乳乳清差异表达蛋白中有9 种蛋白与信号传导有关、6 种糖基化蛋白、5 种分泌型蛋白、5 种具有二硫键蛋白、2 种溶酶体蛋白以及2 种为免疫球蛋白结构域。表1为不同泌乳期牛乳乳清与信号传导相关的丰度差异蛋白，在信号传导相关差异蛋白中，有3 种蛋白在牛初乳乳清中丰度上调，6 种蛋白丰度下调。信号传导蛋白在机体内与代谢途径相关，因此，这些蛋白丰度的上调或者下调均会影响机体的生物反应[29]。表2为牛初乳与牛常乳乳清差异表达糖基化蛋白，在这些糖基化差异蛋白均在牛常乳中丰度上调。并且，附睾分泌蛋白E1、糖基化依赖性细胞黏附分子1、上皮黏蛋白、前列腺素蛋白还与信号传导相关，这些蛋白可能在机体中具有重要的生物学功能。这也说明，一种蛋白在机体内具有多重作用与功能。Cao Xueyan等[30-32]利用蛋白质组学技术研究了人乳与牛乳乳脂肪球膜、乳清中糖基化位点的差异，找到了牛乳中糖基化蛋白，并分析了这些糖基化蛋白的功能。本研究通过对牛初乳、牛常乳乳清差异丰度蛋白的关键词进行了分析，发现了与重要生物学功能相关的蛋白，这些蛋白有的在牛初乳中丰度上调，有的在牛初乳中丰度上调。因此，这些具有重要生物学功能蛋白的发现，能够为功能性食品及乳制品的生产与研发提供重要信息。

2.4 乳清丰度差异蛋白的蛋白质网络互作分析

在机体中，蛋白质与蛋白质之间的结合作用以及相互作用是蛋白质彼此之间传递信号和相互调节行使其功能与作用的基础。因此，本研究将牛初乳、牛常乳乳清丰度差异蛋白进行蛋白质网络互作分析，对于揭示牛乳乳清蛋白质的生物学功能并找到具有关键蛋白具有重要意义，结果如图5所示。在60 种牛初乳与牛常乳乳清差异表达蛋白中，有14 种蛋白在String数据库中被收录，通过分析发现有10 种蛋白的17 种相互作用。其中，具有高连接度的为黄嘌呤脱氢酶/氧化酶、免疫球蛋白λ样多肽1。黄嘌呤氧化酶的功能主要是参与机体内核酸的分解代谢以及促进铁的吸收与转运[33]。免疫球蛋白λ样多肽1主要会影响机体对乳脂的合成代谢[34]。因此，这些高连接度的牛乳乳清差异蛋白很可能是调节整个系统代谢和信号转导途径的关键节点，具有非常重要的作用。

图5 牛初乳与牛常乳乳清差异蛋白的蛋白质互作网络Fig. 5 Protein-protein interaction networks of differentially expressed whey proteins between bovine colostrum and mature milk

3 结 论

本研究利用iTRAQ蛋白质组学先进技术，对牛初乳、牛常乳乳清蛋白的组成及丰度差异进行了鉴定与分析。在599 种鉴定的具有定量信息的乳清蛋白中，发现了60 种差异丰度乳清蛋白。与牛常乳相比，牛初乳中存在25 种丰度上调表达蛋白，35 种丰度下调表达蛋白，说明牛初乳与牛常乳在蛋白质丰度上存在较大差异。通过GO功能注释、功能关键词、蛋白质网络互作等生物信息学分析发现，差异蛋白主要参与的生物过程为转运；主要参与的分子功能为顶端质膜；主要参与的细胞组成为蛋白结合。并找到了9 种与信号传导有关的乳清差异蛋白，以及具有高连接度的黄嘌呤氧化酶与免疫球蛋白λ样多肽1。本研究对牛初乳与常乳乳清蛋白丰度的差异进行了深入研究，找到了重要的功能性蛋白，这些蛋白的发现能够为日后生产及优化功能性乳制品提供理论依据。