苦荞麦不同部位代谢轮廓及活性成分分布

柴 多，王美婷，姜雨萌，刘泷泽，肖 琳，王缤晨，董 亮

（大连工业大学食品学院，国家海洋食品工程技术研究中心，辽宁 大连 116034）

荞麦，学名鞑靼荞麦，是一年生双子叶蓼科草本植物，开发较早，品种丰富。目前，荞麦属在全球范围内广泛分布，在世界上有约15 个种和2 个变种，主要集中分布在北半球欧亚大陆的温带地区。我国的荞麦品类繁多，具有10 个种，其中主要的品种有苦荞和甜荞，且资源丰富，是全世界最大的荞麦出口国。荞麦具有很强的环境适应能力，能够在贫瘠的土壤、寒冷区域和高海拔区域正常生长[1-2]。苦荞是一种健康食品的原料[3]，具有抗氧化、抗炎和抗高血压等保健作用[4]，可用作食用抗氧化剂和营养增强剂等。研究发现，苦荞含有大量的黄酮类物质，且其含量远高于其他品种的普通荞麦[5]，而芦丁是荞麦中特有的一种含量丰富的黄酮类化合物，是具有抗氧化和消炎作用的主要活性物质。因此，苦荞作为一种优质的原料用于黄酮类物质的工业提取，在苦荞深加工领域有着重要的应用。同时，苦荞中的甾醇、蛋白质以及脂肪等营养物质的含量也比常见的粮食作物要高出很多，是一种具有较高营养价值的粮食作物[6-7]，具有较高的开发应用前景。因此，广大科研工作者对荞麦中活性成分[8]、保健功能[9-11]等方面进行了大量的研究。张莉等[12]利用高效液相色谱法对苦荞叶、茎、根中的槲皮素含量进行测定，发现同一种苦荞叶中槲皮素含量最高。有实验选取了苦荞芽苗菜粉、苦荞叶粉及籽粒粉，比较其中3 种黄酮类成分含量，苦荞芽苗菜粉中芸香苷、槲皮素的含量明显高于荞麦叶粉、籽粒粉，而山柰酚含量则以籽粒粉中的最高[13]，同时有研究测定了不同地区苦荞样品的游离酚和结合酚进行了并检测其抗氧化性能，其中对羟基苯甲酸，阿魏酸和原儿茶酸是主要的酚酸[14]。王世霞等[15]对7 种苦荞籽粒的水分、灰分、氨基酸、脂肪酸、淀粉、蛋白质以及功能组分黄酮和多酚的含量进行了测定，结果表明因地域差异导致苦荞麦的营养及功能性成分的种类和含量差别不显著，Janes等[16]还对同一批苦荞的苦荞壳、麸皮及苦荞粉中的挥发性风味物质进行了探究，仅在荞麦碎粒中鉴定出某些化合物，如(E,E)-2,4-庚二烯醛、(E)-2-癸烯醛和(E,E)-2,4-癸二烯醛等，而在荞麦粉或麸皮中未鉴定出这些化合物。

目前关于苦荞的研究大多集中在活性成分的鉴别和保健功能的开发等方面，而苦荞作为一种营养价值较高的杂粮食品的开发一直相对缓慢，相关的基础研究和加工设备研究较少，这也造成了其加工过程中营养和活性物质损失较大。因此，开展苦荞籽粒中不同部位的代谢物质及活性成分分布的研究工作对指导苦荞深加工中营养和活性的保持具有重要的理论指导和应用价值。本实验应用代谢组学法，将苦荞麦种子细分为荞麦壳、麸皮、胚部及胚乳4 个部位，利用气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）联用法分别对每一个部位的代谢物进行检测和定量分析，并利用高效液相色谱对苦荞不同部位的活性成分进行测定，从而更细致全面地构建苦荞营养物质的轮廓，为苦荞的深加工提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

苦荞 山西省大同市东方亮生命科技有限公司；三甲基硅咪唑 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；硅烷衍生化试剂N-甲基-N-(三甲基硅基)三氟乙酰胺、N-叔丁基二甲基甲硅烷基-N-甲基三氟乙酰胺（N-methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide，MTBSTFA）（＞97%）、甘氨酸、丙氨酸等19 种氨基酸标准品 美国Sigma-Aldrich公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

7890A/5975C GC-MS仪 安捷伦科技有限公司；BS224S电子分析天平 赛多利斯科学仪器；Scientz-10ND型冷冻干燥机 宁波新芝生物科技有限公司；Cleanert Silica（硅胶）SPE固相萃取柱 天津博纳艾杰尔科技有限公司；TTL-DC型多功能氮吹仪、CR22N型高速离心机 日本日立公司；VORTEX3型旋涡振荡混合器 德国IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 原料处理

选取优质带壳苦荞麦籽粒，将苦荞壳手工剥离放置待用，把剩余无壳荞麦用镊子分开，取出其中胚部放置待用，将剩余部分压碎，过90 目不锈钢筛，筛出部分为胚乳，剩余部分为麸皮部分。将荞麦壳、麸皮、胚部、胚乳用球磨仪磨成粉备用。

1.3.2 氨基酸标准曲线的制备

分别将19 种氨基酸标准品配制成1 mg/mL的标准品母液，并配制成19 种氨基酸质量浓度均为5 μg/mL的氨基酸标准液，分别取20、40、80、160、240 μL的氨基酸混标溶液，加入10 μL内标（0.3 mg/mL的L-4-氯苯丙氨酸溶液）后氮吹仪吹干，加入360 μL乙腈复溶，旋涡振荡后，再加入40 μL的MTBSTFA于70 ℃衍生30 min，最后取1 μL溶液进样，绘制19 种氨基酸标准曲线。

1.3.3 游离氨基酸的提取及测定

1.3.3.1 游离氨基酸的提取

分别取300 mg的荞麦壳粉、麸皮粉、胚部粉及胚乳粉，各加入80%的甲醇溶液5 mL，旋涡振荡2 min后室温下置于超声清洗仪中，功率100 W超声15 min，取出后旋涡振荡2 min，10 000 r/min离心15 min，取1 mL上清液加入10 μL L-4-氯苯丙氨酸溶液（0.3 mg/mL），氮吹仪吹干，取360 μL乙腈复溶，加入40 μL MTBSTFA，在70 ℃的条件下反应30 min。

1.3.3.2 游离氨基酸的测定

取1 μL制备好的氨基酸提取样品，通过GC-MS对样品中的氨基酸种类及含量进行测定。色谱条件：色谱柱为Agilent HP-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；柱温：初始温度60 ℃，随后以5 ℃/min升温至300 ℃，保持5 min；载气为氦气，流速1 mL/min，进样口温度260 ℃。质谱条件：电子电离源，电离能量70 eV；离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃；采用单离子检测扫描模式选择需要检测的离子，离子扫描范围m/z 40～450。

1.3.4 糖类物质的提取及测定

1.3.4.1 糖类物质的提取

取苦荞壳粉、麸皮粉、胚部粉及胚乳粉各100 mg，各加入80%的甲醇溶液5 mL，旋涡振荡2 min后超声处理15 min，取出后旋涡振荡2 min，10 000 r/min离心15 min，取50 μL上清液，加入30 μL质量浓度为10 μg/mL的核糖醇溶液作为内标，用氮吹仪吹干后，加入260 μL吡啶复溶，再加入40 μL衍生化试剂（三甲基硅咪唑），70 ℃加热30 min。

1.3.4.2 糖类物质的测定

取1 μL制备好的糖类物质提取样品，通过GC-MS对样品中的糖类物质的种类及含量进行测定。色谱及质谱条件与1.3.3节一致，采用全扫描模式（Scan模式）采集。

1.3.5 脂类物质的提取及测定

脂类物质的提取参照Chai Duo等[17]的方法。

脂肪酸甲酯的测定方法：取1 μ L 制备好的脂肪酸甲酯提取样品，通过G C-M S 对样品中的脂肪酸甲酯种类及含量进行测定。色谱条件：A g i l e n t HP-5MS色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；柱温：初始温度60 ℃，随后以10 ℃/min升温至180 ℃，然后以5 ℃/min升至270 ℃，再以9 ℃/min升至300 ℃；载气为氦气，流速1 mL/min，进样口温度260 ℃。质谱条件及采集方式同1.3.4节。

游离脂肪酸的测定方法同1.3.4节。

1.3.6 黄酮类物质的提取及测定

1.3.6.1 黄酮类物质的提取

取苦荞荞麦壳粉、麸皮粉、胚部粉及胚乳粉各200 mg于离心管中，加入2 mL 80%的甲醇溶液，超声处理1 h，10 000 r/min离心15 min，取上清液，重复3 次，将上清液合并，用氮吹仪吹干，200 μL甲醇复溶，待测。

1.3.6.2 色谱条件

色谱柱：Phenomenex Chrom-CloneC18柱（4.6 mm×250 mm，5.0 μm）；柱温（30.0±5）℃；进样体积1 0.0 μ L；流速1.0 0 m L/m i n；流动相为0.1%甲酸溶液（A），甲醇（B），梯度洗脱：0～16 min，90%～58% A，10%～42% B；16～20 min，58%～54% A，42%～46% B；20～35 min，54%～15%，46%～85% B；检测波长：260、280、320、308、369 nm。取1.3.6节条件下制备的上清液1 mL经0.22 μm有机相滤膜过滤，待进行高效液相色谱法测定。

1.4 数据统计

2 结果与分析

2.1 苦荞不同部位游离脂肪酸及脂肪酸甲酯含量分析

运用GC-MS对苦荞的荞麦壳、麸皮、胚部及胚乳进行代谢轮廓分析，共分析鉴定出19 种氨基酸、12 种脂肪酸甲酯、6 种糖类、20 种游离脂肪酸。由表1可以看出，苦荞麦的各个部位中都含有丰富的游离脂肪酸及脂肪酸甲酯，其中苦荞麦的胚部的脂肪酸甲酯及游离脂肪酸的种类最多，含量最高；荞麦壳中的脂肪酸甲酯及游离脂肪酸的种类最少，含量也最少。在检测出的苦荞的脂肪酸甲酯中，十六烷酸、9,12-十八碳二烯酸、9-十八碳烯酸比其他种类的脂肪酸甲酯含量高出很多，并且主要存在于苦荞麦的胚部。其中9-十八碳烯酸又称油酸，是一种单不饱和脂肪酸，广泛存在于动植物体内，具有一定的保健功能，可以起到预防心血管疾病的作用，并且可以降低高血脂症患者血脂水平[18-19]。9,12-十八碳二烯酸又称亚油酸，以甘油酯的形式存在于动植物油脂中，是一种人体无法合成的必须氨基酸，有很好的降血压的作用[20-21]。苦荞麦各个部位也含有种类丰富的游离脂肪酸，其中含量较高的游离脂肪酸有棕榈酸、硬脂酸、1-棕榈酸及β-谷甾醇，且在胚部中的含量明显高于其他部位。十七烷酸及花生四烯酸仅在胚部中被检测出来，在其他3 个部位并无分布。在苦荞中检测出的甾醇类物质具有良好的降血脂及抗菌的作用[22-23]。

在荞麦的麸皮中共检测出10 种脂肪酸甲酯，其中含量最高的是9-十八碳烯酸，为3.24 mg/g，并检测到了18 种游离脂肪酸，含量最高的是棕榈酸，为85.38 μg/g，其次是硬脂酸及1-棕榈酸，含量分别为51.73 μg/g和50.55 μg/g，同时，麸皮中的β-谷甾醇含量也较高。如图1所示，苦荞胚部中含有12 种脂肪酸甲酯，含量较高的是9-十八碳烯酸33.77 mg/g、9,12-十八碳烯酸29.48 mg/g及十六烷酸20.51 mg/g，同时在苦荞胚部中检测出20 种游离脂肪酸，其中β-谷甾醇的含量高达114.66 μg/g，另外含量较高的还有棕榈酸104.04 μg/g、硬脂酸77.18 μg/g及1-棕榈酸61.09 μg/g。在苦荞的荞麦壳中仅检测到2 种脂肪酸甲酯，分别是十六烷酸和二十四烷酸，且含量都比较低，分别为0.46 mg/g和0.13 mg/g。同时在荞麦壳中检测出16 种游离脂肪酸，其中含量较高的是棕榈酸76.4 mg/g、硬脂酸50.57 mg/g及1-棕榈酸38.44 mg/g。在胚乳中检测到10 种脂肪酸甲酯，含量都较低，未检测到9-十六碳烯酸和三十烷酸。同时检测出15 种游离脂肪酸，含量最高的同样是棕榈酸111.46 μg/g，其次是硬脂酸66.25 μg/g和1-棕榈酸41.60 mg/g。

表1 苦荞不同部位脂肪酸甲酯及游离脂肪酸的含量Table 1 Relative contents of fatty acid methyl esters and free fatty acids in different parts of tartary buckwheat seeds

图1 苦荞胚部中基础代谢物总离子流图Fig. 1 Total ion current chromatograms of basic metabolites in tartary buckwheat germ

2.2 苦荞不同部位糖类物质的含量分析

表2 苦荞不同部位糖类物质的含量Table 2 Relative contents of carbohydrates in different parts of tartary buckwheat seeds mg/g

如表2所示，苦荞麸皮中检测出6 种糖类物质，含量均不高，其中含量最高的是蔗糖5.71 mg/g。苦荞胚部中同样检测出6 种糖类物质，其中蔗糖含量高达42.76 mg/g，占检测出的糖类的总含量的89.9%。在苦荞的荞麦壳中仅检测出D-葡萄糖这一种糖类物质，且含量较少仅为0.15 mg/g，其他糖类并未检测出。苦荞的胚乳中检测出4 种糖类物质，分别是D-葡萄糖0.08 mg/g、D-海藻糖0.03 mg/g、D-(+)-呋喃糖0.09 mg/g及蔗糖0.07 mg/g，且这几种糖类物质的含量均不高，同时胚乳中未检测到D-葡萄糖醇和肌醇。可以看出，苦荞麦的胚部及麸皮部分糖类含量较高，种类较多，而胚乳中检测出来的糖类物质含量则明显少与麸皮及胚部，苦荞麦壳中糖类物质含量最少，仅检测到了D-葡萄糖，并未检测到其他糖类。其中含量最高的糖类物质是蔗糖，蔗糖是植物体内最主要的糖类，且蔗糖在苦荞麦中主要分布在苦荞麦的胚部，其他糖类的含量明显低于蔗糖。

2.3 苦荞不同部位氨基酸含量分析

苦荞麸皮中共检测到19 种氨基酸（表3），其中含量最高的氨基酸是谷氨酸，高达1.66 mg/g，占麸皮中所检测到的氨基酸总含量的78.3%，含量最低的氨基酸是蛋氨酸，仅为2.21 μg/g。苦荞的胚部中同样检测到19 种氨基酸，其中含量最高的氨基酸同样是谷氨酸，含量高达5.55 mg/g，占胚部中所检测到的氨基酸总含量的82.1%，其余氨基酸含量较高的有丙氨酸119.55 μg/g、天冬氨酸241.10 μg/g及天冬酰胺169.74 μg/g等。胚部中含量最少的氨基酸是谷氨酰胺，仅为4.34 μg/g。在苦荞的荞麦壳中共检测到15 种氨基酸，并未检测到蛋氨酸、半胱氨酸、赖氨酸及组氨酸。苦荞荞麦壳种含量最高的氨基酸是天冬酰胺，含量为149.77 μg/g，占荞麦壳中所检测到的氨基酸总含量的43.9%。荞麦壳中含量最少的氨基酸是甘氨酸，仅为3.79 μg/g。在苦荞的胚乳中19 种氨基酸均被检测出来，其中含量最高的氨基酸是谷氨酸334.16 μg/g，占胚乳中所检测出的氨基酸含量的58.7%。由表3可以看出，苦荞麦的各个部位均有种类丰富的氨基酸，其中荞麦壳中未检测到蛋氨酸、半胱氨酸、赖氨酸及组氨酸，其余各部位均检测出19 种氨基酸。其中胚部中的氨基酸含量明显多于其他3 个部位，且含量最多的氨基酸为谷氨酸，在麸皮及胚乳中含量最多的氨基酸也是谷氨酸，荞麦壳相对于其他3 个部位氨基酸的含量最少，且种类也最少。

表3 苦荞不同部位氨基酸的含量Table 3 Relative contents of amino acids in different parts of tartary buckwheat seeds μg/g

2.4 苦荞不同部位活性成分含量分析

如表4所示，在苦荞的麸皮中检测出含量较高的是香草酸28.40 μg/g、芦丁24.64 μg/g及对香豆酸20.87 μg/g，含量最少的活性成分是槲皮素4.32 μg/g。在苦荞的胚部中检测出6 种活性成分，槲皮素并未检测出来，其中芦丁的含量最多，为40.79 μg/g，占胚部中所检测到的活性成分总含量的48.6%，含量最少的活性成分是山柰酚4.84 μg/g。在苦荞的荞麦壳中共检测到5 种活性成分，未检测到丁香酸和对香豆酸，其中芦丁的含量远高于其他4 种物质的含量，高达106.00 μg/g，占荞麦壳中所检测到的活性成分总含量的81.8%，含量最少的活性成分是绿原酸4.65 μg/g。在苦荞的胚乳中同样只检测到5 种活性成分，未检测到丁香酸和槲皮素，各种活性成分的含量较为相似。可以看出各部位活性成分都较丰富，其中荞麦壳中的活性成分含量最高，胚乳中活性成分含量最少。同时由表4可以看出，芦丁是苦荞中含量最为丰富的营养物质，且在荞麦壳中含量最高，其次是胚部、麸皮，在胚乳中的含量最少。芦丁又称为芸香苷、VP，是一种广泛存在于荞麦、大黄等植物中的黄酮类化合物糖苷，具有很高的药用价值。芦丁能够清除羟自由基、氧自由基、过氧化氢自由基等自由基[24]，这些自由基是导致人体很多疾病的原因之一。同时芦丁也具有消炎[25]、抗癌[26-27]等作用，并且在防止心脑血管疾病方面也有很大的作用[28]。另外，所检测出的绿原酸也具有广泛的生物活性，具有一定的清除自由基及抗炎抗癌作用[29-30]，已被广泛应用于食品、医药、保健等领域。

表4 苦荞不同部位活性成分的含量Table 4 Contents of bioactive ingredients in different parts of tartary buckwheat seeds μg/g

综上所述，苦荞中的基础营养物质如脂类、氨基酸和糖类，在胚部的含量相比其他部位最高，其原因在于胚部作为荞麦种子生命活力最强的部位，在萌发过程中需要大量的营养物质合成新的组织和器官。相比于胚部，麸皮组织中的基础营养物质含量较小，但也明显高于壳和胚乳部分的含量，而胚乳部分含有大量的淀粉，其主要生理作用在于为种子萌发提供能量。苦荞的中如黄酮类等生理活性物质主要分布在麸皮部分，但是个别物质如芦丁在壳中的含量很高。现阶段，荞麦的食用方式主要以磨粉制成相应的荞麦面粉为主，因此，为了更好的保持荞麦营养和保健功效，应在磨粉过程中尽量保留荞麦的麸皮部分，同时注意对胚部的保护。随着人们生活水平的日益提高，人们的保健意识也越来越强，更营养更健康的全谷物食品越来越受到消费者的欢迎，这也客观的要求面粉或像苦荞麦这类杂粮在加工制粉过程中对胚部和麸皮部分的保护甚至保留。通过本研究同时发现，苦荞麦壳芦丁含量高，可以作为芦丁潜在的原料资源进行开发，为苦荞麦资源的综合开发和利用打下坚实的基础。

3 结 论

GC-MS能够有效的对苦荞的代谢轮廓进行分析。苦荞中的氨基酸、脂类和糖类等基础营养物质主要分布在胚部和麸皮中，而黄酮类等生理活性物质主要分布在麸皮中，在苦荞的加工制粉中应注意对这两部分的保护或保留，其中芦丁在荞麦壳中含量最大，荞麦壳可以作为芦丁潜在的原料资源进行开发。