转醛醇酶与大鼠脉络膜新生血管形成的相关性及其作用机制

(重庆医科大学附属第二医院眼科，重庆 400010)

脉络膜新生血管(choroidal neovascularization，C N V)也称为视网膜下新生血管(subretina l neovascularization，SRNV)，可出现在许多眼底疾病中，如年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)，病理性近视和脉络膜撕裂等[1]。由于新生血管管壁的通透性较正常血管高，可引起反复出血及渗出，最终造成瘢痕形成甚至视力丧失，但目前临床上尚无特殊的有效治疗措施。其发生机制目前尚未完全明确，主要与缺氧、炎症、视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)细胞的衰老、Bruch膜老化及破裂、细胞内脂质沉积、玻璃膜疣的形成以及各种细胞因子的刺激有关[2]。

转醛醇酶(transaldolase，TAL)是磷酸戊糖途径(pentose phosphate pathway，PPP)非氧化阶段的关键酶[3]，其主要调控PPP产生还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)和5-磷酸核糖，前者广泛参与生物体内多种代谢反应，充当供氢体和还原当量的角色，可维持谷胱甘肽(glutathione，GSH)保持还原状态。因此，TAL是生物新陈代谢所必需的。已有研究[4-9]表明，TAL对氧化应激、淋巴细胞凋亡、神经多发性硬化、炎症和恶性肿瘤等病理过程中有着重要作用。

本实验小组前期通过蛋白质组学研究已经发现，TAL在已确诊发生CNV的湿性AMD患者的泪液中表达显著上调(P＜0.05；未发表资料)，但其机制尚不明确。本研究进一步探讨TAL，NADPH和GSH在实验性CNV中表达的变化及TAL活性变化，尝试发现TAL与CNV机制上可能的联系，为研究CNV的机制以及治疗靶点提供新的思考。

1 对象与方法

1.1 对象

采用重庆医科大学动物中心提供的无特定病原体(specific pathogen free，SPF)BN大鼠20只，雄性，6～8周龄，体重200～250 g。TAL活性测定试剂购自美国Sigma公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒和RIPA蛋白提取试剂盒购自碧云天生物技术有限公司，大鼠TAL，NADPH，GSH和内参β-Actin引物购自美国Cell Signaling Technology (CST)公司，人视网膜色素上皮ARPE-19细胞本实验室保存，siRNA试剂盒、高速离心机购自美国Thermo Scientific公司，DMED培养基购自美国Corning公司，胎牛血清购自德国Capricorn公司，垂直电泳槽Mini Protean Tatra、凝胶成像系统ChemiDoc XRS购自美国Bio-Rad公司，移液器购自德国Eppendorf公司，海德堡激光扫描眼底血管造影机购自德国Leica公司，多波长激光机为美国科医人Novus Varia Dpss，光学显微镜为OlympusBX50。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及造模

随机将20 只B N 大鼠分为对照组和实验组：每组10 只(20 只眼)，其中对照组未做干预，实验组进行造模。7%水合氯醛现配现用，0.7 mL/100 g，腹腔注射。复方托品卡胺滴双眼散瞳，检查大鼠眼前节及眼底均正常，氪离子激光治疗机光凝选用参数531 nm，曝光时间0.1 s，光斑直径100 μm，激光功率150 mW，围绕视盘距视盘等距离视网膜处光凝5个点。根据文献[10]，造模后第21天麻醉散瞳后，两组大鼠腹腔内注射20%荧光素钠0.1～0.2 mL进行眼底荧光造影，观察新生血管生成情况后摘除眼球，去除眼前节及玻璃体。

1.2.2 TAL 酶活性测定

参照Lachaise等[9]描述的方法改良，TAL活性为读取NADH光密度衰变率参照TAL标准品活性得出。配置反应终体系含有5 mmol/L 6-磷酸果糖，0.5 mmol/L 4-磷酸赤藓糖，1.75 U/mL α-磷酸甘油脱氢酶，0.15 mmol/L NADH，10 U/mL磷酸丙糖异构酶，加样10～50 μg总蛋白，室温下在340 nm处连续读取吸光度30～60 min，至吸光度降为0.1～0.2为止。比较对照组和实验组中TAL活性，做统计学分析。

1.2.3 蛋白质印迹法检测大鼠眼内TAL，NADPH和GSH 水平

提取大鼠R PE-Br uch膜-脉络膜复合体蛋白后，采用BCA试剂盒测定蛋白浓度。各组取蛋白40 μg进行凝胶电泳，250 mA转膜120 min；5%脱脂牛奶室温下封闭60 min，TBST洗膜，每次10 min，共3次；4 ℃下孵育一抗过夜，洗膜10 min，共3次；室温下孵育二抗60 min，洗膜10 min，共3次。β-Actin作为总蛋白定量内参照。免疫印迹结果经ChemiDoc XRS图像分析系统作半定量分析。

1.2.4 细胞来源及分组

采用本实验保存的人视网膜色素上皮ARPE-19细胞。分组为正常对照组，阴性对照组(加入LipofectamineTM2000稀释液)，实验组(加入TALsiRNA/LipofectamineTM2000复合物)。

1.2.5 siRNA 转染

根据制造商Invirogen提供的LipofectamineTM2000转染试剂转染ARPE-19细胞。转染前24 h将处于对数生长期的ARPE-19细胞接种到6孔板，细胞汇合度需达80%～90%。用适量不包含血清的DMEM 培养基稀释siRNA 寡聚物，并轻轻混匀。使用LipofectamineTM2000前轻轻混匀，稀释适量试剂加入DME M无血清培养基中，轻轻摇动混匀后在室温下孵育5 min。将稀释后的LipofectamineTM2000和稀释后的siRNA寡聚物轻轻混匀，在室温下孵育20 min，以形成复合物。将siRNA寡聚物/LipofectamineTM2000复合物2 mL加入包含ARPE-19细胞和培养基的孔中，轻轻摇动使之充分混合。正常对照组不做干预，阴性对照组中加入scrambled-siRNA 2 mL，在转染后4～6 h更换新鲜培养基，37 ℃，5% CO2培养箱孵育48 h。

蛋白质印迹法检测上述3组细胞在转染48 h后TAL，NADPH和GSH的蛋白表达，方法及步骤同前。

1.3 统计学处理

采用SPSS 21.0软件分析。数据以均数±标准差(x±s)表示，2组间差异采用Student’st-test，3组以上的组间差异采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FFA 结果

已有研究[10]表明，光凝造模后7 d大鼠开始出现CNV，21 d达到高峰，之后CNV变化不明显，因此本研究选择造模后21 d进行眼底荧光造影。正常大鼠眼底造影显示视网膜血管粗细均匀、管壁完整，血管周围无荧光素渗漏；实验组可见5个围绕视盘的激光斑，每处均出现明显荧光渗漏，造影早期呈现高荧光，晚期荧光斑扩散并持续不退(图1)。

2.2 TAL 活性比较

对照组与实验组TAL活性的比较见表1，结果显示实验组中TAL活性较对照组中TAL活性明显增强(P＜0.001)。

2.2 蛋白质印迹法检测造模后大鼠RPE-Bruch 膜-脉络膜复合体中TAL，NADPH 和GSH 蛋白表达的结果

软件密度扫描分析显示实验组TAL的表达水平较对照组明显上升(P=0.005)，NADHP和GSH的表达水平较对照组明显下降(P＜0.05，图2)。

表1 正常对照组与实验组TAL活性比较Table 1 Comparison of TAL activity between the control and experimental groups

2.2 蛋白质印迹法检测siRNA 转染后ARPE-19 细胞中TAL，NADPH 和GSH 蛋白表达的结果

软件密度扫描分析显示实验组TA L 的表达水平较对照组明显下降(P ＜0.01)，N A D H P 和G S H 的表达水平较对照组明显上升(P ＜0.05，图3)。

3 讨论

CNV作为湿性AMD的主要特点，迄今尚无早期确诊及治愈方法[11]。CNV发生发展过程中有年龄、免疫、光损伤、氧化应激和遗传等多种因素参与其中，RPE细胞在其中起着重要调控作用[12]。正常情况下，Bruch膜是两种细胞间的重要屏障，湿性AMD患者的RPE细胞由于衰老等众多因素，其吞噬和代谢光感受器外节膜盘的功能下降，胞浆中累计脂褐素不断沉积在Bruch膜上，形成玻璃膜疣。多种因素同时作用使Bruch膜破裂，各种刺激因素可直接或间接作用于脉络膜毛细血管内皮细胞(choroidal microvascular endothelial cells，CEC)，从而促使新生血管由脉络膜长入RPE下，形成CNV。

TAL是PPP中非氧化阶段重要的关键酶，主要通过调控PPP途径氧化和非氧化阶段之间的平衡，从而调控PPP途径的两大产物：5-磷酸核糖和NADPH。其中，NADPH作为供氢体参与生物体内的多种代谢反应，充当还原当量的角色，维持GSH保持还原状态。研究[13]表明：非氧化阶段产生的还原当量NADPH至少占总量的44%。总而言之，TAL作为非氧化阶段的关键酶对于保证细胞新成代谢所需要的NADPH的供应具有重要意义。已有研究[4-9]表明，TAL对HIV引起的氧化应激、白血病、神经多发性硬化、恶性肿瘤和细胞凋亡等疾病和病理过程中有重要作用，但目前尚未有TAL在CNV中的研究文献。本实验小组前期通过蛋白质组学研究已经发现，TAL在已确诊发生CNV的湿性AMD患者泪液中表达显著上调，因此，深入研究TAL在CNV发生发展过程中的作用及可能的调控机制，将有助于揭发CNV的病理机制，并将为CNV的防治提供新思考。

本研究发现：实验组大鼠TAL活性及蛋白的表达明显高于对照组，并且NADPH和GSH的蛋白表达明显低于对照组。推测在CNV发生发展过程中，TAL可能通过影响PPP途径减少NADPH和GSH的产生并增强眼底氧化应激。Banki等[5,13]发现TAL的过表达降低了6-磷酸葡萄糖脱氢酶的活性，从而减少了NADPH和GSH的产生，使细胞易对凋亡信号敏感而发生凋亡，增强了人Jurkat白血病T细胞系的氧化应激。进一步体外实验[5]证明，在TALsiRNA转染后的ARPE-19细胞中，TAL蛋白表达下调的同时增强了NADPH和GSH的蛋白表达水平。由此推断，TAL可通过PPP途径影响NADPH和GSH的表达。

A MD的主要病变区在黄斑部，组织病理学研究[14]表明，患病早期病变区的光感受器就受到不同程度的损害。视锥细胞生长因子(rod derived cone survival factor，RdCVF)是一种硫氧还蛋白样蛋白，Cronin等[15]发现RdCVF的破坏会导致光感受器功能障碍以及增加氧化应激的易感性。而NADPH是硫氧还蛋白还原酶的辅助因子，对于还原RdCVF是必需的：RdCVF一旦被氧化，就只能被硫氧还蛋白还原酶还原[16]。因此推测TAL还可能通过PPP影响NADPH的生成，从而导致氧化型RdCVF还原障碍，但其具体机制有待进一步探究。还原型GSH是细胞质中由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸残基组成的一种三肽，是细胞内抗氧化系统的重要组成部分。已有研究[17]表明，还原型GSH在视网膜光损伤中起重要保护作用，保护细胞免受过量脂质过氧化损伤。本实验中实验组中GSH的含量明显低于对照组，说明GSH的减少确实存在于CNV的发生发展过程中，而NADPH作为GSH还原酶的辅酶，其表达下调使氧化型GSH不能被还原，使视网膜失去GSH的保护作用，从而加剧CNV的发生发展。然而，在缺氧条件下RPE细胞中TAL，NADPH和GSH的蛋白表达是否有变化，需要进一步研究探讨。

综上所述，本实验验证了TAL在大鼠CNV模型中蛋白质表达上调且活性有显著提高，同时减少了眼内NADPH和GSH的表达水平；在TALsiRNA转染后的ARPE-19细胞中，TAL的表达下调同时增强了NADPH和GSH的表达水平。揭示TAL可能通过影响PPP途径减少NADPH和GSH的表达，增强眼内氧化应激及细胞凋亡，从而参与CNV的发生发展。本实验首次在大鼠CNV模型中研究TAL的活性及蛋白质表达变化，结果与我们前期研究已确诊发生CNV的湿性AMD患者泪液中TAL的蛋白表达趋势一致(未发表资料)，并验证了TAL与NADPH和GSH的蛋白质表达水平的关系，为探索CNV的发生机制及寻找治疗靶点提供了新的思考。