婴幼儿食品和乳品中左旋肉碱测定的方法验证

石永倩 张天博

【摘 要】为了验证采用分光光度法测定婴幼儿食品和乳品中左旋肉碱含量方法的准确性与可靠性，判断测定结果是否达到标准要求，文章采用《食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中左旋肉碱的测定》中的方法测定乳品中左旋肉碱的含量，并根据《合格评定化学分析方法确认和验证指南》中的相关规定对其线性、线性范围、检出限、定量限、精密度、回收率6个参数进行验证。

【关键词】左旋肉碱;脂肪代谢;方法验证;适用性

【中图分类号】TS252.7 【文献标识码】A 【文章编号】1674-0688（2021）12-0025-03

左旋肉碱，别名L-肉碱或维生素BT，分子式C7H15NO3，是一种白色晶体或者白色透明粉末，易溶于水、酒精和碱性溶液，200 ℃以上熔化分解。左旋肉碱是由俄国科学家Gulewitsch和Krimberg在骨骼肌中发现的。左旋肉碱是参与生物体新陈代谢的重要物质，具有多种生理功能。奶粉中的左旋肉碱是促进奶粉中的脂肪分解、代谢和供能的重要营养素，同时能促进体内的脂肪转化为能量，属于一种类氨基酸类的营养物质[1]。人体内的左旋肉碱主要来源于羊肉、牛肉、猪肉等红色肉类，奶粉中适量添加左旋肉碱对人体无害，可以促进体内脂肪代谢和利用。婴幼儿饮食结构比较单一，主要饮食来源为各种乳制品，主要的能量来源为乳制品中的脂肪，宝宝体内缺乏左旋肉碱，导致脂肪的利用率下降，不利于宝宝体格发育，添加左旋肉碱可以提高宝宝对奶粉中脂肪的利用率[2]。

本文研究的目的在于通过对方法的线性、线性范围、检出限、定量限、精密度、回收率6个指标进行验证，证明采用这种检测方法测定婴幼儿食品和乳品中左旋肉碱的可行性[3]。

1 试验方法——《食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中左旋肉碱的测定》（GB 29989—2013）

1.1 原理概述

将样品中的蛋白质用高氯酸溶液沉淀，过滤后的滤液用氢氧化钾溶液皂化，使左旋肉碱游离。在乙酰肉碱转移酶的催化作用下，游离的左旋肉碱和乙酰辅酶A反应生成乙酰肉碱和游离的辅酶A。辅酶A和显色剂发生显色反应，可从工作曲线上查得相应的质量浓度，据此计算样品中左旋肉碱的含量。

1.2 试验用品

1.2.1 试剂和标准品

13%的高氯酸溶液（HClO4）;4 mol/L的氢氧化钾溶液（KOH）;10 mol/L的氢氧化钠溶液（NaOH）;2-硝基苯甲酸;N-2-羟乙基哌嗪-2-乙烷磺酸;乙二胺四乙酸二钠;乙酰辅酶A（CoA）;乙酰肉碱转移酶（CAT）。其中，乙酰辅酶A（CoA）和乙酰肉碱转移酶（CAT）需要在2～8 ℃的环境中保存。试验用水均为三级水，所用试剂均为分析纯。左旋肉碱标准品（C7H15NO3）：纯度≥98%。

1.2.2 配制标准溶液

配制浓度为80 g/mL的左旋肉碱标准储备液：将左旋肉碱标准品在（102±2）℃的烘箱中烘干2 h后冷却至室温，称取20 mg（精确至0.1 mg）放入小烧杯中，用三级水溶解放入250 mL容量瓶中并定容摇匀。

配制左旋肉碱标准工作液：分别吸取0.5 mL、1 mL、2 mL、3 mL、5 mL的标准储备液放入25 mL的容量瓶中，用三级水定容混匀。注意现用现配。

1.3 仪器和设备

分析天平（型号：AL207-IC）：购于梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司，感量为0.1 mg;pH计（型号：PB-10）：购于赛多利仪器（北京）有限公司，精度为0.01;离心机：转速≥1 500 r/min;恒温水浴锅：温度可控制在（40±2）℃;分光光度计（型号：TU-1901）。

1.4 分析过程

1.4.1 样品预处理

在小烧杯中称取5 g（精确至0.1 mg）奶粉样品，用30 mL、40 ℃的水溶解至100 mL的容量瓶中。高氯酸溶液加10 mL后，上下混合均匀，静置20 min。用三级水定容后混匀，用定量滤纸过滤至100 mL的三角瓶中。

吸取20 mL滤液于50 mL的小烧杯中，用氢氧化钾溶液调节滤液的pH值，当pH值达到12.5～13.0，放入40 ℃水浴锅中60 min。经冷却后，用高氯酸调节pH达到7.0～7.5。小心地转入50 mL的容量瓶中，定容混匀，放入4 ℃的冰箱过夜。用时取出放置至室温后，用注射器吸取上清液用滤膜过滤待用。

1.4.2 绘制标准曲线

在2个1 cm的比色皿中分别吸取2.0 mL的左旋肉碱标准工作液，分别加入0.8 mL的显色工作液和100μL的CoA溶液混匀，放入分光光度仪中，在412 nm的波长下5 min后进行归零。在外槽的比色皿中加入100μL的CAT溶液混匀，反应10 min后比色。制作標准曲线，横坐标为左旋肉碱标准工作液浓度，纵坐标为吸光度值[4]。

1.4.3 测定样品

按照步骤“1.4.2”测定处理好的样液的吸光值，查得样液浓度。

1.4.4 数据处理

样品中左旋肉碱含量为X，用质量分数mg/100 g表示，按照如下公式计算：

     X=×100

上式中：c为查得的样液浓度，单位为μg/mL;V为滤液体积，单位为mL;m为样品质量，单位为g。

2 方法验证参数

2.1 线性和线性范围

左旋肉碱标准储备液浓度为80μg/mL。吸取0.5 mL、1 mL、2 mL、3 mL、5 mL的左旋肉碱标准储备液定容到25 mL，经过计算，该系列标准溶液中左旋肉碱的质量浓度分别为1.6μg/mL、3.2μg/mL、6.4μg/mL、9.6μg/mL、16μg/mL。以左旋肉碱标准工作液的浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，制作标准曲线。标准曲线线性方程结果见表1。

2.2 检出限和定量限

左旋肉碱的检出限采用空白标准偏差法评估，即通过分析大量（n≥10）样品空白确定检出限（LOD）。本次实验通过10次样品空白独立测试，计算出检测结果的算数平均值（X）和标准偏差（S）确定检出限（LOD）。计算公式如下：

LOD=X+3S

上式中：LOD为方法检出限（mg/100 g）;X为10次独立空白平均值;S为10次独立空白标准偏差。

定量限（LOQ）的确定主要是从其可信性考虑，为了增加数据的可信性，将10倍的检出限作为本检验方法的定量限。实验结果见表2。

当样品称样量为5.000 0 g时，该方法的检出限為0.187 mg/100 g，定量限为1.87 mg/100 g。

2.3 精密度

本实验进行精密度验证，选取1个婴幼儿配方奶粉样品进行7次重复性测定，结果见表3。

结果表明：经重复性实验得到的相对标准偏差为1.77%，符合（GB/T 27417—2017）的要求。

2.4 回收率

本实验的回收率验证是通过将已知浓度的分析物加入样品中，使加标后样品中的左旋肉碱浓度分别处于标准曲线的低、中、高3个浓度，按照预定的分析方法进行检测，计算左旋肉碱的回收率[5]，但婴幼儿配方奶粉中左旋肉碱含量比较高，无法达到标准曲线低浓度范围，故加标样A将已知浓度的分析物加到空白中，加标样B、C加入同一样品中，其结果见表4。

3 评价与结论

3.1 评价

3.1.1 曲线线性范围评价

本方法得到的标准曲线方程：Y=0.055 92×C+0.000 73，线性范围为0～16μg/mL，相关系数R为1.000 0，方程拟合度好。符合“对于准确定量的方法，线性回归方程的相关系数不低于0.99”的规范要求[6-7]。

3.1.2 检出限和定量限评价

采用本检测方法检测婴幼儿食品和乳品中的左旋肉碱，当称样量为5.000 0 g时，检出限为0.187 mg/100 g，定量限为1.87 mg/100 g，低于国标GB 29989—2013中的检出限，即2 mg/100 g，符合要求[6，8]。

3.1.3 精密度评价

本实验通过对同一样品进行7次测定，得到重复性实验的相对标准偏差为1.77%，符合GB/T 27417—2017的要求。

3.1.4 回收率评价

通过对样品的加标实验，测得加标平均回收率分别为96.4%、94.95%、98.3%。符合GB/T 27417—2017附录A中方法回收率偏差范围要求[9]。

3.2 结论

此次方法验证中，仪器设备均经过检定并在有效期内，检测方法有效，实验过程未受到其他干扰，检测结果真实准确。通过对左旋肉碱方法的验证，各项指标均符合实验需求，故本试验方法能准确测定婴幼儿食品和乳品中左旋肉碱的含量。

参 考 文 献

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[2]刘瑛，唐延彬，秦虹.婴儿配方奶粉中左旋肉碱添加量的研究进展[J].母婴世界，2019，5（10）：292-294.

[3]向忠权，蒲国荣，韦志明，等.左旋肉碱的合成与应用[J].化工技术与开发，2017，42（2）：15-21.

[4]GB 29989—2013，食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中左旋肉碱的测定[S].

[5]黄玲珠，庞恩，李庚.保健品中铬测定的方法学验证[J].食品安全导刊，2018（133）：174-176.

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