超声波辅助-绿色低共熔溶剂提取茉莉花黄酮的工艺优化

都宏霞，刘宴秀,2，严忠杰，胡梓恒，刘高荣，吴晨雨

（1.南京科技职业学院化工与材料学院，江苏南京 210048)（2.盐城工学院化学化工学院，江苏盐城 224051）

绿色化学一直是化学领域的研究热点，低共熔溶剂（Deep Eutectic Solvents，DESs）是继离子液体（Ionic liquids，ILs）之后由Abbott等人2003年首次合成的一类绿色新型溶剂[1]，一般是选取2～3种绿色无毒的原料作为氢键受体和氢键供体，通过较强的分子间氢键作用而制得的低共熔混合物。低共熔溶剂既拥有与离子液体同样优秀的理化性质，又更好地克服了离子液体合成复杂、耗能高、成本高等缺点，且具有成本低、易制备、易存放、可回收、安全无毒、生物可降解、环境友好等其他有机溶剂无法比拟的优点，已逐渐受到广泛关注[2,3]。目前DESs已经逐步代替有机溶剂和离子液体应用于天然植物提取和分离方面，具有巨大潜力[4-6]。

茉莉花，属木犀科素馨属,花瓣如雪，花香清雅，《本草纲目》中早有记载，在我国广泛种植，是一种药食同源的植物，具有很高的观赏性和实用性，深受人们喜爱。研究表明,茉莉花中含有多糖、黄酮、挥发油等多种活性成分，具有清虚火、祛寒积、治疗疮毒、祛除坏疽、肿瘤等活性功效，作为主要成分的茉莉花黄酮（flavonoids of Jasmine，FOJ）具有良好的抗氧化、抗炎、抗菌、抗癌、调节免疫力等作用[7-11]。目前，对于黄酮类物质的提取溶剂主要是水或甲醇、乙醇、乙酸乙酯等传统的有机溶剂[12-15]，为了克服有机溶剂的污染，探索一种新型绿色、高效的茉莉花黄酮提取技术非常必要。

本文设计并制备8种DESs，首次用于茉莉花黄酮的提取，系统比较多种提取技术，并结合响应面法研究FOJ的最佳提取工艺，旨在提供一个更加绿色、高效、经济、环保的FOJ新型提取方法，更好地促进茉莉花资源的深度开发，为绿色化学的发展和中国天然产物的研究提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

茉莉花，北京同仁堂药店；芦丁标准样品，北京恒元启天化工技术研究所；氯化胆碱，Aladdin公司；乙醇、醋酸钾、丙二醇、1,3-丁二醇、1,2-戊二醇、蔗糖、三氯化铝、山梨醇、甜菜碱盐酸盐、无水甜菜碱均为分析纯。

1.2 仪器与设备

ME204E-02型电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；FS-250N型超声波提取仪，上海生析超声仪器有限公司；7600型紫外分光光度计，上海菁华科学仪器制造有限公司；TDL-50B型低速台式离心机，上海安亭科学仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 标准曲线的建立

以芦丁作为标准对照品，通过测量其在紫外分光光度计的吸光度，建立芦丁标准曲线，测定FOJ的含量。

准确称取芦丁标准品5.0 mg，用浓度为50%的乙醇定容至25.0 mL。准确称取芦丁标准品（0.2 mg/mL）0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于6只比色管中，分别用5.0 mL的50%乙醇，3.0 mL的0.1 M AlCl3溶液和5.0 mL的1 M醋酸钾溶液，摇匀，同法制成空白对照：静置反应40 min，充分接触混合，并在波长415 nm处检测其吸光度值。

1.3.2 DESs的制备

参考Abbott的方法[16]，设计了8组DESs（见表1），选择氯化胆碱、无水甜菜碱和甜菜碱盐酸盐作为氢键受体，分别与不同的氢键供体按摩尔比 1:1，含水量50 mol，在80 ℃水浴条件下加热搅拌，直至溶液澄清，冷却至室温，分别得到DES1-8备用。

1.3.3 FOJ提取量的测定

式中：Y为FOJ提取量，mg/g；c为试样的测定质量浓度，mg/mL；V为滤液体积，mL；D为稀释倍数；m为原料质量，g。

1.3.4 FOJ提取技术的比较

表2 提取技术条件表Table 2 Factors of extraction technology

精确称取茉莉花粉 20 g，通过水提（Water Extraction，WA）、醇提（Ethanol Extraction，ET）[17,18]、低共熔溶剂提取（Deep eutectic solvents Extraction，DESs）、微波提取[19,20]、(Microwave Extraction，MA)、超声波提取（Ultrasonic Extraction，UA）[21,22]技术来提取 FOJ，提取条件见表 2，将提取液抽滤，以转速4000 r/min的速度进行离心10 min，将离心后溶液静置，取上层清液，过0.45 µm滤膜，对D101大孔树脂进行预处理后，上样，待吸附平衡后，用去离子水、质量浓度为30%、50%、70%、90%的乙醇溶液洗脱，每个浓度均洗脱3柱体积（BV），流速为1 BV/h，收集90%乙醇浓度的洗脱液，于45 ℃旋转蒸发进行浓缩后，再用50%的乙醇溶液进行稀释得到FOJ，根据上述方法测其吸光度，计算得出FOJ含量。

1.3.5 UA-DES-8提取FOJ的单因素实验

1.3.5.1 摩尔比对FOJ提取量的影响

在液料比40:1，含水量50 mol，超声时间15 min，超声功率120 W的条件下，取甜菜碱盐酸盐与蔗糖的摩尔比为2:1、1:1、1:2、1:3、1:4作为变量，研究摩尔比对FOJ提取量的影响。

1.3.5.2 液料比对FOJ提取量的影响

在超声时间15 min，超声功率120 W，甜菜碱盐酸盐:蔗糖:水=1:1:50的条件下，分别取液料比40:1、60:1、80:1、100:1、120:1、140:1、160:1，研究液料比对FOJ提取量的影响。

1.3.5.3 超声时间对FOJ提取量的影响

在超声功率 120 W，甜菜碱盐酸盐:蔗糖:水=1:1:50，液料比140:1的条件下，分别取超声时间5、10、20、30、40 min，比较超声时间对FOJ提取量的影响。

1.3.5.4 超声功率对FOJ提取量的影响

在超声时间 20 min，甜菜碱盐酸盐:蔗糖:水=1:1:50，液料比140:1的条件下，分别取超声功率7.5、30、60、90、120、150 W，比较超声功率对FOJ提取量的影响。

1.3.5.5 含水量对FOJ提取量的影响

在液料比140:1，超声时间20 min，超声功率60 W的条件下，取甜菜碱盐酸盐、蔗糖与水的摩尔比为1:1:40、1:1:60、1:1:80、1:1:100、1:1:120作为变量，研究含水量对FOJ提取量的影响。

1.3.6 响应面法优化FOJ最优提取工艺条件

使用Design-Expert.V 8.0.6软件中Box-Behnken组合设计来确定实验最优工艺[23-25]，在单因素实验基础上，选择液料比、超声功率、含水量为3因素，每个因素选择三个对FOJ影响较大的水平，进行3因素3水平的响应面试验，并以提取量作为响应值，各因素的三个水平分别采取-1、0、1作为编码，如表3。

表3 响应面试验分析因素水平表Table 3 Factors and levels of response surface methodology

1.4 数据处理

使用Origin 8和Design-Expert.V 8.0.6进行数据处理、图表制作及数据分析。

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线的结果分析

经测定分析，得回归方程为Y=32.87X+0.14，其系数R2=0.9998，在0～0.08 mg/mL范围内线性关系良好。

图3中，样品1～4、7～8与空白组中氨基酸态氮含量相近，表明在同等发酵方式发酵条件下，添加增香酵母不会对薏仁碎米酱油中氨基酸态氮的含量造成很大影响，而同时添加两种增香酵母的样品5、6中氨基酸态氮含量则明显低于空白组，分析可能是总酸含量降低所致；由图3所示，样品7、8与样品1～4相比，其氨基酸态氮含量相对较高，表明分别在不同发酵时期添加两种增香酵母时氨基酸态氮含量较高，样品7中氨基酸态氮含量高达0.872 g/100 mL，略高于样品8，其含量与未添加增香酵母的样品9相比增长了2.41%，因此，为提高酱油风味，样品7是较好的添加方式。

2.2 FOJ提取技术比较分析

图1 FOJ提取技术的比较Fig.1 Comparison of different technology for extraction of FOJ

通过WA、ET、UA、MA技术和8种DESs提取FOJ，数据表明：超声波辅助提取效果优于微波提取；DESs溶剂提取效果远高于传统的水提和醇提，FOJ提取量比水提和醇提分别提高了 3.67～4.13 mg/g和3.26～3.72 mg/g。这是因为DESs中含有大量容易与黄酮形成氢键的羟基和氨基，可以增加黄酮在DESs中的溶解度，同时在超声波辅助的作用下，可以更快速的溢出，促进FOJ提取量增加。其中DES-8，即以甜菜碱盐酸盐和蔗糖所合成的DES效果最好，茉莉花黄酮提取量为6.38 mg/g，结果见图1。因此，本研究以UA-DES-8为提取技术，进一步研究FOJ提取的最佳工艺条件。

2.3 单因素实验

2.3.1 DES-8摩尔比对FOJ提取量的影响

结果如图2所示：甜菜碱盐酸盐和蔗糖的摩尔比从2:1到1:4，FOJ提取量呈先升后降的趋势，主要原因是DES-8体系中甜菜碱盐酸盐的极性相对较低，而糖基的极性相对较高，当摩尔比为1:1时，DES-8溶液的极性刚好达到最佳的效果。之后随着蔗糖比例的增加，体系极性增加的同时粘度也随之增加，FOJ在体系中，扩散速度减小，导致提取量逐渐下降。所以当甜菜碱盐酸盐和蔗糖的摩尔比为1:1时，FOJ提取量最高，为6.38 mg/g。

图2 摩尔比对FOJ提取量的影响Fig.2 Effect of molar ration on extraction yield of FOJ

2.3.2 液料比对FOJ提取量的影响

图3 液料比对FOJ提取量的影响Fig.3 Effect of liquid-material ratio on extraction yield of FOJ

结果如图3所示：当液料比低于140:1时，液料比和 FOJ提取量呈正相关，提取量最高达到 13.71 mg/g；当液料比继续增大时提取量下降，因为液料比的增加可以使体系的溶解度升高，促进茉莉花细胞破壁，使内容物溢出率增加，但当溶解度大到一定程度时，可能会发生饱和的现象，导致部分黄酮无法溶解，进而影响提取效果。因此，最佳液料比为140:1。

2.3.3 超声时间对FOJ提取量的影响

结果如图4所示：在5～20 min时FOJ提取量呈上升趋势，但在20～40 min时反而呈下降趋势，这是因为时间越长，超声波产生的能量就越大，在溶液中所形成的空化效应就越强，对茉莉花细胞壁的破坏程度就越强，提取量就越高。但是，随着超声波作用时间的延长，提取量反而降低，主要是由于随着提取时间的增加，温度也逐渐增加，体系同时处于超声辐射和热效应的作用之下，可能会产生双重降解[26,27]，因此20 min之后提取量降低。结果表明最佳超声时间是20 min，比文献报道[8]的最优工艺的超声时间少 25 min，此时提取量为14.23 mg/g。

图4 超声时间对FOJ提取量的影响Fig.4 Effect of extraction time on extraction yield of FOJ

2.3.4 超声功率对FOJ提取量的影响

图5 超声功率对FOJ提取量的影响Fig.5 Effect of ultrasonic power on extraction yield of FOJ

结果如图5所示：FOJ的提取量先升后降，影响趋势与文献报道一致[28]，在超声功率为7.5～60 W之间一直增加，从60 W之后趋于平稳后略有降低。因为随着超声波功率的增加，空化效应也更加剧烈，分子的运动速度和加速度都会增加，分子扩散就越快，超声波对细胞壁的破碎作用越强，黄酮物质溢出率越多。但当超声功率大到一定程度时，会发生“饱和效应”[26]，导致提取量降低。因此最佳超声功率为60 W，此时FOJ提取量为14.34 mg/g。

结果如图6所示，FOJ的提取量随着含水量的增加先增后降，在含水量为80 mol时达到最大，为15.13 mg/g。主要原因是水可以降低提取溶剂的粘度，并且调节极性，从而在超声波的辅助作用下，促进溶剂的扩散，有效的提升茉莉花细胞破壁的能力，增加FOJ的提取量。而含水量增加到80 mol之后，体系的粘度开始降低，极性开始增加，会导致分子间氢键的断裂、超分子结构的丢失，最终导致提取量的下降[29,30]。

图6 含水量对FOJ提取量的影响Fig.6 Effect of water content on extraction yield of FOJ

2.4 响应面试验结果与优化分析

2.4.1 响应模型的建立与分析

基于单因素试验结果，选取液料比(A)、超声功率(B)和含水量(C)三个主要因素为自变量，以FOJ提取量为响应值(Y)，采用 Design-expert软件按照Box-Behnken实验设计了15组实验，12组为析因点实验，3组为重复零点实验，进行交叉设计实验，结果见表4，方差与误差统计分析见表5。

利用Design-Expert软件对实验数据进行分析，得到二次多项回归方程：

Y=15.17+0.19A+0.85B+0.30C-0.15AB+1.06AC+0.44BC-0.91A2-0.40B2-0.83C2

其中Y为提取量，A、B和C分别为对应液料比、超声功率和含水量的编码。由表 5的数据可知：模型的p值为0.0002，模型极显著（p＜0.01）；失拟项p值为0.2859，结果不显著（p＞0.05），表明拟合状况良好。方程决定系数R2=0.9890，CV为1.41%＜10%，能真实的反映本模型，可用此模型分析响应面的变化。信噪比（Adeq Precision）为20.22大于4，表示模型合理[31]。由方差F值可知，各因素对提取量影响为：B（超声功率）＞C（含水量）＞A（液料比）。由表5还可知，因素中B、C、AC、BC、A2、C2的影响极显著（p＜0.01），因素A、B2的影响显著（p＜0.05），而AB的影响不显著，该方程可适用。

表4 响应面分析实验设计与结果Table 4 Design and results of the response surface methodology(RSM) and box-behnken

表5 提取率响应面拟合回归方程的方差分析结果Table 5 ANOVA results of extraction rate response surface fitting regression equation

注：*：差异显著,p ＜0.05；**:差异极显著，p ＜0.01；R2= 0.9890，Adj R2= 0.9693，Pre R2=0.8551。

2.4.2 响应面交互作用分析与优化

图7 液料比和超声功率交互作用对提取量的影响Fig.7 Response surface of Y=f (A, B)

图8 含水量与液料比交互作用对提取量的影响Fig.8 Response surface of Y=f (A, C)

各因素间交互作用得到响应面曲线图。图7～图9分别显示超声功率、料液比、含水量的交互作用对FOJ提取量的影响结果。曲线走势越陡，表明该因素影响越显著；曲线走势越平滑，则表明该因素影响较小[32]。图7中，随着超声功率的增加，FOJ提取量逐渐上升，在90 W时达到最大，之后趋于平缓；图8中，随着液料比的增加，影响十分显著，FOJ提取量呈先上升后下降的趋势，在液料比为149:1 (mL/g)时出现最大值；图9中，随着含水量的增加，FOJ提取量呈现先升后降的趋势，影响显著，含水量在94 mol时达到最高点。这是因为超声功率越大，空化效应越剧烈，分子运动速度越快，黄酮物质溢出越多，但当超声功率大于90 W时，发生“饱和效应”，影响黄酮溢出。而适当的水可以增加体系的黏度、调节体系极性，利于黄酮物质溢出，但过量的水会使体系黏度变低、极性变高，导致氢键断裂，使提取量降低。

图9 含水量与超声功率交互作用对提取量的影响Fig.9 Response surface of Y=f (B, C)

根据Design-Expert软件得出在液料比、超声功率和含水量交互作用影响下，最优提取工艺为：液料比为148.91:1 (mL/g)，超声功率为90 W，含水量为94.50 mol，在此条件下模型预测的提取率为15.90 mg/g。结合实验室具体情况，修正提取条件为液料比 149:1(mL/g)，超声波功率90 W，含水量94.50 mol，摩尔比1:1，超声时间20 min，所得FOJ提取量为15.24 mg/g，与预测值相差0.66 mg/g，说明模型与实际数据拟合较好，证实所得模型的有效性，同时证实响应面对UA-DES-8提取FOJ的参数优化具有较强的可行性和应用性。

3 结论

本文建立了一种绿色、高效、经济、环保的茉莉花黄酮新型提取方法。通过比对水、乙醇和8种DESs在内的10种溶剂，以及超声波和微波提取对FOJ提取量的影响，证实DESs的效果都优于水和乙醇，超声波提取的效果优于微波，且发现甜菜碱盐酸盐作为氢键受体的提取效果要优于目前普遍使用的氯化胆碱。因此，选用甜菜碱盐酸盐和蔗糖所构成的DES体系。结合单因素实验、响应面优化实验和实验室条件，证实FOJ提取最佳条件是：甜菜碱盐酸盐：蔗糖:水=1:1:94.50，液料比149:1 (mL/g)，超声波功率90 W，超声时间20 min，在此条件下，FOJ的提取量为15.24 mg/g,与模型预测结果相差0.66 mg/g，证实模型的有效性和可行性；FOJ提取量比传统的水提提高了12.99 mg/g，相当于水提的 677%，比文献报道的通过正交优化超声波提取提高了7.64 mg/g，相当于其200%[8]，充分说明 UA-DESs技术可高效提取茉莉花黄酮。本文为天然植物活性成分绿色提取提供了一定的数据支撑，同时为进一步开发茉莉花资源提供了一种新思路。