乳酸菌发酵蓝莓乳清混合体系体外抗氧化特性分析

王文琼，孙志勇,2，黄冬成，张杰龙，张志贤，李颖，鲁茂林，顾瑞霞

（1.扬州大学食品科学与工程学院，江苏乳品生物技术与安全控制重点实验室，江苏扬州 225127）

（2.江苏新美星包装机械股份有限公司，江苏张家港 215618）

（3.黑龙江大三源乳品机械有限公司，黑龙江哈尔滨 150069）

氧化损伤是人体衰老的主要原因，另外其还可引起高血脂、糖尿病及心脑血管疾病等多种疾病[1]。大量研究表明，乳酸菌具有较强的抗氧化能力，能够改善人体肠道内的活性氧分子变化，清除氧化应激产生的多种自由基[2,3]。蓝莓中的花青素，多酚类物质具有很强的抗氧化性，蓝莓果汁经过乳酸菌发酵后，花青素含量提高 15.38%，抗氧化能力显著提高[4]。同时有多项研究发现经乳酸菌发酵后果蔬制品的抗氧化能力显著增强，这是由于乳酸菌在发酵过程中能够水解一些结合酚，释放游离酚，提高其生物利用率，从而提高抗氧化能力。乳清蛋白经过乳酸菌发酵后会产生大量的功能性多肽，具有 ACE抑制活性，抗氧化等功能。研究表明蛋白对花色苷的热稳定性和光稳定性具有一定的保护作用。近年来，蓝莓发酵提高抗氧化的研究很多，乳酸菌发酵对于花青素的保护作用是不容置疑的，乳酸菌发酵可以维持底物基质中的酸性环境，这对于酚类物质及花青素都有着积极的保护作用[5,6]。然而，乳清蛋白与蓝莓果汁中酚类物质的相互作用对体系抗氧化性造成影响，所以提高和稳定蓝莓乳清发酵体系的抗氧化性是目前需要解决的技术难题。

本课题组前期利用乳酸菌对乳清蛋白与蓝莓果汁混合物进行发酵，利用微生物发酵产酸，降低发酵体系pH，保持多酚活性，维持体系颜色稳定，同时利用乳酸菌发酵作用促进蓝莓果浆中活性成分与乳清蛋白对接，产生蛋白-多酚和花色苷复合物提高饮料体系的抗氧化能力[7]。本研究采用乳清蛋白蓝莓果汁体系为原料，考察嗜热链球菌，保加利亚乳杆菌以及嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的混合菌种（以下简称混合菌种）分别发酵24、36、48 h后体系还原能力，羟自由基清除能力，总抗氧化能力，DPPH·清除能力，超氧阴离子清除能力以及抗脂质过氧化能力。旨在以蓝莓乳清为原料通过乳酸菌发酵使酚酸类物质发生脱羧和还原，提高酚酸类物质在人体内的消化和吸收率。同时，利用乳酸菌水解蛋白，增强蛋白质分子与蓝莓花青素分子之间以亲水和疏水作用相互结合，从而对其分子稳定性起到保护作用[8]。将蛋白和多酚的结合物水解为游离酚，提高蓝莓乳清饮料体系的抗氧化性，为蓝莓乳清混合饮料的研发与工艺优化提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品准备

①原料的筛选：选择果实饱满，已经成熟的蓝莓果（2018成熟的大兴安岭野生蓝莓 51°55′ N，124°34′ E），摘除果柄、枝叶，剔除病虫害、变色、变质等质量不合格的蓝莓果，并用清水清洗干净。

②榨汁：将清洗干净的蓝莓果，晾干，取蓝莓100 g，加水榨汁。

③过滤：将蓝莓浆液先用200目纱布单层过滤，再用两层纱布过滤，过滤液600 mL，分装50 mL。

④调配：向过滤完的蓝莓中加入去离子水，使得蓝莓与水的比例为1:5。

⑤加入乳清粉：向调配液中加入 6%的乳清蛋白。

⑥加入6%蔗糖。

⑦调pH：将样品液pH调至7.0。

⑧灭菌：将配置成的蓝莓乳清蛋白饮料置于95 ℃水浴锅水浴灭菌5 min。

⑨接菌发酵：接入保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌（上海昊岳食品科技有限公司提供）以及混合菌种（保加利亚乳杆菌:嗜热链球菌=1:1），接种量为2%（活菌数为7 log cfu/mL），样品置于37 ℃恒温箱培养。

1.2 还原能力的测定

取样品0.5 mL，加入2.5 mL磷酸盐缓冲液（浓度为0.2 mol/L，pH值为6.6）和2.5 mL的1%铁氰化钾溶液，混合均匀。再将混合物在 50 ℃下水浴 20 min后冷却，加入2.5 mL的三氯乙酸溶液（体积分数10%），然后将混合物在5500 r/min下离心10 min。取2.5 mL上层清液，加入2.5 mL蒸馏水和0.5 mL的0.1%的氯化铁溶液，混合均匀，放置 10 min后，在700 nm 处测定其吸光值[9]。实验用坏血酸作为对照组，重复3次，吸光度值越大，饮料还原能力越强。

还原能力=Ai-Aj

式中：Ai为加样品的吸光度；Aj为以水代替清除剂时的吸光度。

1.3 羟自由基清除能力测定

向试管中加入样品（样品用去离子水稀释至 200 mg/mL）1.00 mL，溶液（浓度为10 mmol/L）1.00 mL，水杨酸-乙醇（浓度为10 mmol/L）1.00 mL，最后加1.00 mL（体积分数 0.03%）启动反应，振荡混合，水浴37 ℃，保温30 min，5500 r/min离心7 min，在波长510 nm下测量吸光度值[10]。

式中：As为加样品的吸光度；Ac为不加清除剂时吸光度；A0为以水代替样品的吸光度。

1.4 ABTS+自由基测定

（1）ABTS+自由基储备液的制备

用蒸馏水将 ABTS+·和高硫酸钾分别溶解并混合，使其终浓度分别为7 mmol/L和2.45 mmol/L，在室温、避光条件下放置12～16 h，形成ABTS+自由基储备液。使用前用 60%乙醇或磷酸盐缓冲液(0.2 mol/L，pH 7.4)稀释ABTS+自由基储备液，使其在波长405 nm处吸光度为0.700±0.020，此为ABTS+·工作液。配浓度为0～750 μmol/L的Trolox标准溶液，0.1 mL不同浓度的Trolox溶液与3.90 mL ABTS+·工作液充分混合，反应10 min后，于734 nm波长处测定吸光度，绘制标准曲线。

（2）样品的测定

将样品稀释至 200 mg/mL，使其对ABTS+·工作液产生 20%～80%的抑制率。精确吸取样品稀释液0.10 mL，加入3.90 mL ABTS+·工作液充分混合，在30 ℃反应10 min后，于405 nm波长处测定吸光度，以蒸馏水作为空白对照。样品的 ABTS+自由基清除能力用 TEAC 值（Trolox equivalent antioxidant capacity）表示[11]。

1.5 DPPH自由基清除能力的测定

将样品稀释到200 mg/mL浓度，取样液1.0 mL及4.00 mL浓度为0.12 mmol/L的DPPH·乙醇溶液（乙醇体积分数95%），混匀，室温下避光反应30 min，如有沉淀可在5500 r/min条件下离心5 min。用体积分数为 95%乙醇溶液作参比，于 517 nm测定吸光值。根据下式计算每种样品液对DPPH自由基的清除率[12]：

式中：Ai为加样品液后DPPH·溶液的吸光值；Aj为样品液的吸光值；Ac为未加样品液时DPPH·溶液的吸光值。

1.6 抗脂质过氧化能力测定

用硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）比色法测定样品中丙二醛含量（代表脂质过氧化反应程度）[13]。卵黄悬液：新鲜鸡蛋去除蛋清，卵黄用等体积pH 7.45，0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）配成1:1（m/m）悬液，磁力搅拌10 min，再用PBS稀释成1:25（m/m）的悬液，冷藏备用。测定方法：在离心管中依次加入 40 μL卵黄悬液，10 μL不同质量浓度样品溶液，40 μL 25 mmol/L FeSO4，310 μL PBS（0.1 mol/L，pH 7.45），混匀于37 ℃恒温振荡15 min，取出后加入100 μL质量分数为20%的三氯乙酸溶液和100 μL质量分数为0.8%的TBA溶液，沸水浴15 min，冷却后，3500 r/min离心10 min，吸取上清液，于 532 nm波长处测定MDA-TBA复合物吸光度，按下列式子计算抑制率。

式中：A样为加样品吸光度；A1为空白管吸光度，以水代替样品液。

1.7 超氧阴离子自由基的清除能力的测定

采用邻苯三酚法，在试管中加入Tris-HCl缓冲溶液（50 mmol/L pH 8.2）9 mL，加入样品（用去离子水稀释至0.2 mg/mL）0.6 mL，混合均匀，于25 ℃恒温水浴锅中加热15 min后，加入25 ℃邻苯三酚溶液（以10 mmol/L HCL为溶剂配置成7.5 mmol/L）0.2 mL，混合均匀，于325 nm处测定吸光度，3 min后再次测定吸光度，计算差值记为 ΔA。将样品溶液替换为水，其他操作同上，计算差值记为ΔA0[14]。实验采用抗坏血酸作对照组。根据下列公式计算样品O2-·清除率。

式中：ΔA：加入样品溶液后 3 min内吸光度增加值；ΔA0：以水替代样品溶液3 min内吸光度增加值。

1.8 实验数据处理

每个试验重复 3次，结果表示为平均值±偏差。数据统计分析采用SPSS 11.5软件（p<0.05表示差异显著，p>0.05表示差异不显著），采用Origin 8.5画图。

2 结果与分析

2.1 还原能力

由图1可知，在发酵前，乳清蛋白蓝莓果汁体系的还原能力比蓝莓强，蓝莓的还原能力比乳清蛋白强[15]，主要是蓝莓中含有酚类化合物，如黄烷醇、单宁、花青素等具有较强抗氧化活性[16]。另外，乳清蛋白与多酚形成的结合物具有抗氧化性[17]。乳清蛋白在不接菌，接入嗜热链球菌（发酵24、36、48 h），接入保加利亚乳杆菌（发酵24、36、48 h），和接入混合菌种（发酵0、24、36、48 h）时还原能力差异不显著（p＞0.05）。

图1 乳清蛋白蓝莓体系发酵时间对还原能力的影响Fig.1 The effect of fermentation time on the reducing power of whey protein and blueberry beverage

接种嗜热链球菌的乳清蛋白蓝莓果汁体系在发酵24、36、48 h时还原能力均显著高于接种嗜热链球菌的蓝莓和接种嗜热链球菌的乳清蛋白。接种嗜热链球菌的乳清蛋白蓝莓果汁体系在发酵24、36、48 h时还原能力均高于接种保加利亚乳杆菌和混合菌种的乳清蛋白蓝莓果汁发酵体系。因此嗜热链球菌发酵有利于乳清蛋白蓝莓果汁体系中抗氧化活性成分的保持和提高。有研究发现乳酸发酵更有利于天然产物中抗氧化活性成分的保持[18]。接种保加利亚乳杆菌的乳清蛋白蓝莓果汁发酵体系在发酵24 h和36 h时还原能力显著高于接种保加利亚乳杆菌的蓝莓和接种保加利亚乳杆菌的乳清蛋白，在发酵48 h时还原能力低于乳清蛋白，蓝莓单独发酵。接种混合菌种的乳清蛋白蓝莓果汁发酵体系在发酵24 h和36 h时还原能力显著高于接种混合菌种的蓝莓和接种混合菌种的乳清蛋白，在发酵48 h时还原能力低于蓝莓，乳清蛋白单独接种混合菌种。因此，相比于接种保加利亚乳杆菌和混合菌种，接种嗜热链球菌的乳清蛋白蓝莓果汁发酵体系还原能力最高，发酵24 h时还原能力低于发酵36 h，而发酵36 h与发酵48 h时还原能力差异不显著。

2.2 羟自由基清除能力

相关研究表明乳酸菌在生长繁殖过程中不同程度地提高发酵产品的自由基清除能力[18]。另外，乳酸菌在生长过程中能够产生多种酶类，通过这些酶的转化作用可以将结合态酚酸分解为游离态酚酸，提高发酵原料中酚酸类化合物的生物利用度及抗氧化性[19]。前期研究发现发酵后花色苷含量约为 150～250 mg/100 g样品，总酚含量为6 mg/100 g样品，并且不同发酵时间，花色苷和总酚含量变化显著[7]。

接入嗜热链球菌的蓝莓果汁在发酵36 h时羟自由基清除能力高于发酵前，而发酵24 h和发酵48 h时，羟自由基清除能力与发酵前差异不显著。接入保加利亚乳杆菌的蓝莓果汁在发酵24 h时羟自由基清除能力与发酵前相比降低28.80%，发酵36 h时羟自由基清除能力提高了8.98%，但仍比发酵前低19.82%，发酵48 h时羟自由基清除能力显著提高（p<0.05），比发酵前高5.80%。接入混合菌种的蓝莓果汁在发酵24 h时羟自由基清除能力与发酵前相比显著降低，降低了32.13%。发酵 36 h时羟自由基清除能力提高15.31%，但仍比发酵前低16.81%，发酵48 h时羟自由基清除能力进一步提高，提高了 20.75%。与发酵前相比差异不显著（p>0.05）。接入嗜热链球菌的蓝莓果汁在发酵24 h与发酵36 h时羟自由基清除能力高于接入保加利亚乳杆菌和混合菌种的蓝莓果汁，而在发酵48 h时显著降低（p<0.05）。Vinderola[20]等研究表明，德氏保加利亚乳杆菌对嗜热链球菌菌株表现出强烈的抑制作用。所以，在接入乳酸菌的蓝莓果汁中，接入嗜热链球菌的蓝莓果汁在发酵36 h时羟自由基清除能力最强。

图2 乳清蛋白蓝莓体系发酵时间对羟自由基清除能力的影响Fig.2 The effect of fermentation time on the scavenging capacity of hydroxyl radicals of whey protein and blueberry beverage

由图2可知，接入嗜热链球菌的乳清蛋白蓝莓果汁混合饮料的羟自由基清除能力在发酵24 h和48 h时显著低于接入嗜热链球菌的乳清蛋白和接入嗜热链球菌的蓝莓果汁，在发酵36 h时略高于接入嗜热链球菌的乳清蛋白，显著低于接入嗜热链球菌的蓝莓果汁。原因是乳清蛋白水解后可得到含有抗氧化能力的活性多肽，具备一定的抗氧化能力，蓝莓中的黄酮类化合物与蛋白质之间主要是非共价结合（如氢键、疏水作用），与蛋白质的疏水性位点结合，蛋白质结会发生改变，黄酮类化合物含量减少，最终使得羟自由基清除能力减弱[21]。

2.3 ABTS+自由基清除能力

图3 乳清蛋白蓝莓体系发酵时间对总抗氧化能力的影响Fig.3 Effect of fermentation time of whey protein blueberry system on total antioxidant capacity

由图 3可知，乳清蛋白蓝莓果体系发酵前ABTS+·清除能力最高，乳清蛋白 ABTS+自由基清除能力最低。以不接菌的蓝莓汁为参照，接入嗜热链球菌的蓝莓汁在发酵24 h时，ABTS+自由基清除能力提高，发酵36 h时ABTS+自由基清除能力显著下降，发酵48 h时ABTS+自由基清除能力无显著差异。接入保加利亚乳杆菌的蓝莓汁在发酵 24、36、48 h时ABTS+自由基清除能力均高于发酵前，且清除能力为发酵36 h＞发酵24 h＞发酵48 h。接入混合菌种的蓝莓汁在发酵24、36、48 h时ABTS+自由基清除能力均高于发酵前，且清除能力为发酵36 h＞48 h＞24 h。与不接菌的乳清蛋白蓝莓混合体系相比，接入嗜热链球菌，保加利亚乳杆菌，混合菌种发酵乳清蛋白蓝莓果体系总抗氧化性有所降低，但仍具有较强抗氧化能力，原因是总酚和总黄酮具有较高的抗氧化活性[7]，而饮料中接入的乳酸菌可将简单的酚类物质转化，也可解聚大分子酚类化合物，可能导致了发酵过程中的总酚和总黄酮含量降低[22]。

未接菌的蓝莓乳清混合体系 ABTS+自由基清除能力高于未接菌的蓝莓汁和未接菌的乳清蛋白。由于空气氧化导致花色苷等酚类物质降解，而蓝莓乳清蛋白饮料中乳清蛋白的包裹和结合作用反而对花色苷等多酚类物质起到了稳定和保护作用，使其含量高于蓝莓果汁[23]。由图3可知，在乳清中添加蓝莓，通过乳酸菌发酵后 ABTS+自由基清除能力高于乳清蛋白单独发酵，在发酵24 h时，接入嗜热链球菌，保加利亚乳杆和混合菌种的蓝莓乳清比接入相同菌种的乳清蛋白清除能力分别高14.22%、14.31%和11.71%，在发酵36 h时，接入嗜热链球菌，保加利亚乳杆菌和混合菌种的蓝莓乳清比接入相同菌种的乳清蛋白清除能力分别提高27.37%、11.65%和15.78%。在发酵48 h时接入嗜热链球菌，保加利亚乳杆菌和混合菌种的蓝莓乳清比接入相同菌种的乳清蛋白清除能力分别高34.66%、30.87%和25.25%。在发酵24 h时接入嗜热链球菌，保加利亚乳杆菌和混合菌种的蓝莓乳清混合体系的 ABTS+自由基清除能力比接入相同菌种的蓝莓汁分别低 9.10%、19.45%和 20.77%，比接入相同菌种的乳清蛋分别要高14.22%、14.31%和11.71%，主要是是在乳酸菌的作用下，乳清蛋白结构、组成和含量随着发酵状态发生相应的改变，使得其无法发挥包裹和结合作用，花色苷等多酚物质失去乳清的保护，含量变低从而使得 ABTS+自由基清除能力变低。因此，在乳清蛋白蓝莓混合体系中，接入保加利亚乳杆菌发酵36 h时ABTS+自由基清除能力最好。

2.4 DPPH自由基清除能力

图4 乳酸菌发酵乳清蛋白蓝莓果汁体系DPPH清除能力Fig.4 Lactic acid bacteria fermentation system of whey protein blueberry juice DPPH scavenging capacity

由图4可知，蓝莓不接菌，乳清不接菌和蓝莓乳清不接菌相比，接入蓝莓的乳清饮料DPPH清除能力有显著提高。说明蓝莓和乳清混合之后比单一的蓝莓果汁和单一的乳清蛋白 DPPH·清除能力更强，原因是乳清蛋白与蓝莓多酚结合后产生的复合物具备较强的自由基清除能力。接菌的蓝莓乳清发酵体系与蓝莓乳清不接菌相比，DPPH自由基清除能力有所降低，而在发酵48 h时接入嗜热链球菌，保加利亚乳杆菌，混合菌种的蓝莓乳清发酵饮料 DPPH·清除能力最低。有研究发现，果蔬饮料在发酵过程中可能由于黄酮类物质的不稳定性和发酵过程中产生了分解酚类物质的酶，使得清除自由基的活性物质减少，从而降低了混合发酵体系的DPPH自由基清除能力[24]。接入嗜热链球菌，保加利亚乳杆菌，混合菌种的蓝莓乳清发酵饮料在发酵24 h时，DPPH自由基清除能力均高于60%，清除能力较强。从图中可以看出，在蓝莓乳清发酵体系中，接入嗜热链球菌发酵24 h时DPPH自由基清除能力最高，达到63.01%。

2.5 超氧阴离子清除能力

图5 乳酸菌发酵乳清蛋白蓝莓果汁体系超氧阴离子自由基清除能力Fig.5 Lactic acid bacteria fermentation system of whey protein blueberry juice superoxide anion radical scavenging capacity

由图5可知，在发酵24 h时，接入乳酸菌的蓝莓果汁O2-·清除能力均大于80%，而未接菌的蓝莓果汁O2-·清除能力为58%，数据表明发酵24 h时的蓝莓果汁O2-·清除能力显著提高。原因是乳酸菌在蓝莓汁中生长繁殖，改变了蓝莓的营养物质。发酵后的蓝莓汁O2-·清除能力得到提高[25]。接入嗜热链球菌，保加利亚乳杆菌，混合菌种在发酵 24 h时分别提高23.53%、29.74%和26.70%，但发酵36 h和48 h时超氧阴离子自由基清除能力显著下降，与发酵 24 h相比，接入嗜热链球菌，保加利亚乳杆菌，混合菌种在36 h清除能力分别降低48.89%、69.94%和40.53%，在48 h时分别降低65.57%、78.81%和80.90%，说明蓝莓果汁长时间发酵会降低其抗氧化能力。与未接菌的乳清相比，接菌的乳清发酵液O2-·清除能力更强。与未接菌的蓝莓乳清相比，接入嗜热链球菌，保加利亚乳杆菌和混合菌种的乳清在24 h时的清除能力分别提高34.98%、30.07%和20.22%，与未接菌的蓝莓乳清相比，接入嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的蓝莓乳清发酵饮料O2-·清除能力均有显著提高，在24 h时分别提高32.98%和22.57%（p<0.05），在36 h时分别提高 6.85%和 18.42%，在 48 h时分别提高 1.5%和3.98%。原因是在发酵过程中，由于乳酸菌将乳清蛋白水解成多肽，氨基酸侧链基团释放出来，这些基团具有电子供体作用，能够与超氧阴离子自由基反应，从而提高了O2-·清除能力[26]。因此，在接入乳酸菌的蓝莓乳清发酵体系中，嗜热链球菌发酵24 h时O2-·清除能力最好。

2.6 抗脂质过氧化能力

图6 乳酸菌发酵乳清蛋白蓝莓果汁体系抗脂质过氧化能力Fig.6 The lipid peroxidation ability of lactic acid bacteria fermented whey protein blueberry juice system

由图 6可知，接入嗜热链球菌，保加利亚乳杆菌，混合菌种的蓝莓汁在24、36和48 h抗脂质过氧化能力均高于未接菌的蓝莓汁，说明蓝莓果汁经发酵后抗脂质过氧化能力得到提高。与未接菌的蓝莓乳清相比，接入混合菌种的蓝莓果汁发酵体系在24 h时抗脂质过氧化能力显著提高，达到了 31.30%，提高了24%；接入保加利亚乳杆菌的蓝莓乳清发酵体系抗脂质过氧化能力也有所提高，增长了8.60%。接入嗜热链球菌的蓝莓乳清发酵体系在发酵36 h时抗脂质过氧化能力最高，而在24 h和48 h时，与未接菌蓝莓乳清相比差异不显著（p>0.05）。经保加利亚乳杆菌和混合菌种发酵24 h的乳清蛋白和蓝莓乳清发酵体系抗脂质过氧化能力均有显著提高（p<0.05），而采用混合菌种发酵时抗脂质过氧化能力最高，原因是保加利亚乳杆菌发酵后产生的代谢产物能够防止亚油酸被氧化，而嗜热链球菌所产生的代谢产物对保加利亚乳杆菌的生长繁殖有促进作用[27]。所以蓝莓乳清发酵体系的发酵菌种选用混合菌种，发酵时24 h时，抗脂质过氧化能力达最高。

4 结论

本研究选用保加利亚乳杆菌，嗜热链球菌及其混合菌种对乳清蛋白蓝莓混合体系进行发酵，结果表明尽管蛋白-多酚的作用会降低多酚类物质的体外抗氧化活性，但随乳酸菌发酵有助于蓝莓及蓝莓乳清混合体系抗氧化能力的保持。单独采用嗜热链球菌发酵蓝莓乳清体系36 h时的还原能力最强，羟自由基清除能力最强；单独采用保加利亚乳杆菌发酵蓝莓乳清体系36 h时ABTS+·清除能力最强；单独采用嗜热链球菌发酵蓝莓乳清体系24 h时O2-·清除能力和DPPH自由基最强；采用混合菌种发酵蓝莓乳清体系24 h时抗脂质过氧化能力最强。