阿司匹林联合雷奈酸锶治疗对成骨细胞以及去卵巢大鼠骨密度和骨量的影响

周皖舒 陶周善 顾长斌*

1.皖南医学院第二附属医院老年医学科，安徽 芜湖 241000 2.皖南医学院第一附属医院(弋矶山医院)创伤骨科，安徽 芜湖 241000

骨质疏松症是一种与年龄相关的全身性疾病，以进行性骨量丢失、骨强度降低和骨折风险增加为特征[1]。绝经后的妇女特别容易受到这种骨代谢紊乱的影响。在育龄期间，雌激素通过刺激成骨细胞活动来帮助维持女性的骨量。绝经后妇女雌激素水平降低导致成骨细胞骨形成速率降低，导致骨吸收净增加[2]。此外，绝经后妇女成骨细胞增殖减少，导致破骨细胞分化增强和过度活跃，进而骨质丢失。有学者报道阿司匹林(aspirin，ASP)[3]可能具有抑制骨吸收作用，随后的流行病学报告还发现，经常使用小剂量的ASP或其他非甾体抗炎药经常与骨密度增加相关[4]。已经有基础研究报道ASP具有保护去卵巢大鼠骨量和骨密度的作用[5]。雷奈酸锶(strontium ranelate，SR)是雷尼酸的一种锶盐，目前正被用作治疗骨质疏松症的抗吸收药物。锶在骨重建中起着特殊的作用，锶通过抑制破骨细胞活性减少骨吸收，通过刺激成骨细胞活性促进骨形成[6-7]。鉴于阿司匹林和雷奈酸锶均有抗骨质疏松症的效果，本研究观察阿司匹林联合雷奈酸锶使用对成骨细胞以及对去卵巢大鼠骨量和骨密度的影响，两者联合治疗骨质疏松症的可行性。

1 资料和方法

1.1 细胞培养和成骨细胞实验

来源于新生小鼠颅骨的MC3T3-E1细胞购自中国科学院(上海)典型培养委员会细胞库， α-MEM培养基中含有10%胎牛血清(FBS)和1%链霉素青霉素(100 U/mL)。将MC3T3-E1细胞接种于成骨分化培养基中，24 h后不加入任何药物(Con组)，或者分别加入5 mmol/L的SR(SR组)、加入2 mmol/L的ASP(ASP 组)及同时加入5 mmol/L的SR和2 mmol/L的ASP(SR+ASP组)，共培养14 d后，用4%多聚甲醛固定15 min，用BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒(Beyotime，中国上海)进行碱性磷酸酶染色。碱性磷酸酶检测试剂盒(Beyotime，中国，上海)根据制造商的说明测定ALP活性，并用微量分光光度计在405 nm处读出活性量。茜素红S染色30 min，对矿化结节进行可视化。为了定量评价，本研究用10%的十六烷基氯化吡啶去细胞15 min，上清液在540 nm处读数。

1.2 去卵巢模型建立和指标检测

3个月大的雌性SD大鼠从弋矶山医院中心实验室获取，并在控制温度(22℃～24℃)和湿度(50%～60%)的条件下，保持12 h明暗周期。自由获取标准实验室啮齿动物饮食和水。实验前所有大鼠适应性饲养7 d。根据FDA指南对动物进行背侧双侧切除卵巢手术OVX或假手术。12周后，随机选择20只大鼠(每组10只)以通过测试骨密度(BMD)验证成功的建模。然后将大鼠分为4组，每组10只：OVX(OVX大鼠+生理盐水)，ASP[OVX+ASP，9 mg/(kg·d)]，SR[OVX+SR，300 mg/(kg·d)]，SR+ASP[OVX+ASP，9 mg/(kg·d)+SR，300 mg/(kg·d)]。大鼠的ASP或SR的剂量参考发表的文献[8-9]。治疗12周后，取出左股骨，在10%中性福尔马林缓冲液中固定24 h，随后进行Micro-CT检查和组织切片HE染色检测。将右股骨切片并在液氮中冷冻，用于蛋白质印迹(WB)分析。

Micro-CT检查：左股骨通过锥形束台式Micro-CT(μCT80，Scanco Medical，Brüttisellen，Switzerland)测量，并通过相关分析软件进行评估(μCT80 Evaluation Program v6.5 1，Scanco Medical，Switzerland)。扫描后，选择生长板上方1 mm处股骨远端的松质骨作为VOI，将其限制在股骨内部区域，通过CT分析仪软件绘制自由形状的轮廓来提取骨小梁和皮质骨。使用标准化技术表征松质骨的微结构，以确定相对骨体积(BV/TV，%)，骨小梁厚度(Tb.Th，mm)，骨小梁数目(Tb.N，1/mm)，骨小梁分离度(Tb.Sp，mm)和骨密度(BMD，g/cm2)；通过多平面重整获得三维(3D)图像。

随后左股骨进行病理学检测，用乙二胺四乙酸溶液(EDTA)(Servicebio，G1105)将固定的左股骨脱钙4～6周。样品用标准分级的酒精溶液脱水并包埋在石蜡中。将石蜡中的骨组织纵向切成4 μm的薄片。载玻片用于苏木精和曙红(HE)染色。

接下来对右侧股骨进行蛋白印迹(western blot，WB)检测，在液氮中粉碎后用IP裂解缓冲液从骨组织中提取总蛋白。通过BCA蛋白质试剂盒定量测量蛋白质的浓度。将蛋白质与上样缓冲液混合，并在100℃下煮沸5 min以使其变性。 将50 μg总蛋白通过10%和15%SDS-PAGE分离，并转移到0.45 m的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜中。在室温下用5%脱脂奶粉封闭1 h后，将膜分别与购于Abcam的Notch 1、CBF 1和Jagged 1一抗在4 ℃下孵育过夜，然后在室温下与缀有辣根过氧化物的二抗一起孵育1 h。印迹用ECL试剂(Thermo Scientific，美国)显影。β-actin蛋白用于标准化。通过Image J软件测量每个蛋白条带的总密度。

图1 每组大鼠中ALP和茜素红染色以及平均光密度Fig.1 Average optical density of ALP and Alizarin red staining in each group

1.3 统计学分析

所有数据均以均数±标准差(SD)表示，使用Leven检验方差的同质性。通过单向方差分析(ANOVA)和最小显著差异(LSD)检验确定特定组之间的差异。P<0.05表示差异有统计学意义。所有数据均使用SPSS 19.0软件进行统计分析。

2 结果

2.1 ALP染色和茜素红染色结果分析

如图1所示，ALP阳性细胞染色后呈蓝紫色，其中以SR+ASP组ALP阳性细胞最多。茜素红阳性细胞染色后呈红色，其中以SR+ASP组茜素红阳性细胞最多。根据ALP和茜素红染色的平均光密度的统计分析(图1)，SR+ASP组的ALP阳性细胞和茜素红阳性细胞的平均光密度与SR组和ASP组相比明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)；SR组和ASP组之间，ALP阳性细胞和茜素红阳性细胞的平均光密度也发现有显著差异(P<0.05)。结果表明SR+ASP组成骨细胞活性和矿化功能更强。

2.2 Micro-CT分析

Micro-CT更好地显示了股骨干骺端骨小梁的总体改变情况，骨小梁的微观参数如图2所示。ASP组、SR组、SR+ASP组左侧股骨干骺端骨小梁BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th较OVX组明显升高，而Tb.Sp较OVX组明显降低 (P<0.05)；而SR+ASP组BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th较ASP组和SR组明显升高，而Tb.Sp较ASP组和SR组明显降低(P均<0.05)。

2.3 大鼠组织学变化

HE结果表明，SR联合ASP治疗能更好地保护去卵巢大鼠骨量的流失。如图3所示，与OVX组相比，ASP、SR及SR+ASP组的大鼠骨小梁数量和密度得到明显的改善，而在SR+ASP组表现的最为明显。

图2 4组大鼠股骨干骺端Micro-CT检测结果Fig.2 Results of micro-CT in the femoral metaphysis of rats in the four groups注： OVX组(a)、ASP组(b)、SR组(c)及SR+ASP组(d)；与OVX组相比，*P<0.05；与ASP组相比，#P<0.05；与SR组相比，&P<0.05。

图3 4组大鼠股骨干骺端HE切片检测结果Fig.3 Results of HE slices in the femoral metaphysis of rats in the four groups注：OVX组(A)、ASP组(B)、SR组(C)及SR+ASP组(D)(×20)。

2.4 Notch信号通路改变

和OVX组比较，ASP组、SR组及SR+ASP组的大鼠Notch信号通路被激活；Notch 1、CBF 1和Jagged 1表达上调，组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。和ASP组和SR组比较，SR+ASP组Notch 1、CBF 1和Jagged 1表达水平显著升高，差异比较有统计学意义(P<0.05)。见图4。

图4 使用WB检测Notch 1、CBF 1和Jagged 1和β-actin的相对表达Fig.4 Relative expression of Notch 1, CBF 1, and Jagged 1 to β-actin using Western blotting注：与OVX组相比，*P<0.05；与ASP组相比，#P<0.05；与SR组相比，&P<0.05。

3 讨论

以前有报道称，一旦雌性大鼠被切除卵巢，观察到的骨质疏松症的主要表现是破骨细胞数量增加，溶骨作用增强和高骨转换，骨吸收超过骨形成。在人类绝经后骨质疏松症中观察到的骨代谢变化与卵巢切除(OVX)大鼠的骨代谢变化之间有许多相似之处，因此，OVX大鼠被认为是绝经后妇女骨质疏松症的有效动物模型[10]。因此本研究选取去卵巢大鼠作为研究模型探讨使用SR和ASP联合疗法防治雌激素缺乏大鼠的骨质流失。OVX大鼠用SR和ASP联合治疗12周。Micro-CT和HE染色切片结果显示，SR组和ASP组股骨骨密度较OVX组明显增加，骨小梁的结构得到了显著改善；而SR+ASP组骨密度以及骨小梁微观结构较SR组和ASP组均匀明显改善。

本研究发现SR+ASP组取得较好的疗效可能和每种药物单独作用机制有关。以前的研究表明ASP通过作用于Fas/FasL信号通路，抑制T淋巴细胞对骨髓间充质细胞的凋亡作用，促进成骨分化，抑制破骨细胞分化，从而干预骨坏死的发生发展[3，11]。另外，环氧合酶-2(COX-2)可能通过改变基质金属蛋白酶-1(MMP-1)和白细胞介素(IL)-6(21)的表达来促进骨吸收。ASP是COX-2的有效抑制剂，也可能降低COX-2，从而抑制骨质疏松时骨吸收的发展[12]。SR是为数不多的针对骨质疏松的药物之一，它既能刺激成骨细胞，从而促进骨形成，又能抑制破骨细胞(减少骨吸收)[6-7]，从而减少脊椎和非脊椎骨折[13]。由于SR和ASP均具有促进成骨和抑制破骨作用，SR+ASP组取得较好的疗效可能和两者作用机制叠加有关。

在哺乳动物中，Notch家族有4个受体Notch1-4和5个受体结合配体Jagged1/2和δ样1/3/4[14]。当同源配体与Notch受体结合时，Notch信号被激活，导致γ分泌酶的一系列蛋白水解和Notch胞内信号的释放[15]。先前的研究表明，Notch信号通路是骨形成的调节因子，Notch信号激活可以促进成骨细胞的分化和矿化[16]。由于Notch信号通路在骨形成中的重要作用，本研究进一步探索了各组大鼠骨组织中Notch信号通路改变，结果发现，较Con组，ASP组、SR组以及SR+ASP组Notch 1、CBF 1和Jagged 1表达明显上调，而SR+ASP组Notch 1、CBF 1和Jagged 1表达上调最为显著，这表明SR联合ASP治疗可能通过激活Notch信号通路来实现；由于Notch信号通路对成骨细胞分化及增殖的重要作用，因此可以解释SR+ASP组更高的骨量和骨密度，说明两者联合使用对骨形成刺激作用更强。

总的来说，本研究初步使用雷奈酸锶联合阿司匹林干预去卵巢诱导骨质疏松症，结果表明联合使用较单独使用效果更佳，而这种疗效可能通过Notch信号通路介导。由于本研究使用的模型以及样本量有限，因此有必要进一步探索这种治疗方案的优势；而且本研究选取药物剂量也是参考文献，是否是最佳剂量还需要进一步研究。