5种云南牛肝菌营养成分和抗氧化活性分析与评价

王晶波，刘婷婷，任 硕，杨 倬，秦 文，王丽媛，卓 勤，宫照龙，沈 葹

（中国疾病预防控制中心营养与健康所，国家卫生健康委微量元素营养重点实验室，北京 100050）

牛肝菌（Boletus spp.）是一种食药兼用的大型真菌，其风味独特、营养丰富，富含蛋白质、氨基酸、维生素和铁、锌、钙等矿物质元素[1-2]，以及多糖、多酚、萜类等具有抗氧化、抗肿瘤、增强人体免疫力等作用的功效成分[3-6]，在人体保健和疾病治疗方面有巨大的发展潜力[7]。全世界已知牛肝菌属菌类已有1 024种，我国已知可食用的就有199种[8]。其分布广泛，云南是我国牛肝菌种类最丰富的地区之一[9-10]，云南产牛肝菌占我国牛肝菌出口量的70%[11]。

目前对牛肝菌的相关研究多为种类的鉴别和保存方法，营养成分、功效成分的相关研究多集中在新鲜牛肝菌的研究。牛肝菌种类繁多，生活中人们常食用的种类却为少数，多以菌类的颜色区分，包括白、黄、黑、红等。除旺季外，农民保存牛肝菌多采用烘干或晒干技术，该技术会引起营养成分和结构的变化，为充分利用干品的营养成分，有必要对常见牛肝菌的干货商品进行营养成分分析。

挑选云南当年产的、生活中最常见的5种野生牛肝菌干品进行营养成分分析，包括蛋白质和氨基酸组成、矿物质元素、多糖和多酚的含量，以及多酚的DPPH·清除能力和ABTS·清除能力。综合评价了5种牛肝菌的营养价值，补充《中国食物成分表》牛肝菌干品的数据空白，为提升牛肝菌的功效价值与市场开发提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

野生牛肝菌干品样品，市售。5种牛肝菌名称和产地分别为白牛肝菌（Boletus albus，楚雄）、红牛肝菌（Boletus rubeus，普洱）、黄牛肝菌（Boletus auripes，大姚）、黑牛肝菌（Boletus nigricans，师宗）、美味牛肝菌（Boletus edulis，普洱），设为样品1号～5号。将样品粉碎，过120目筛后置阴凉干燥处备用。

混合氨基酸标准液（2.5 μmoL·mL-1），Wako公司；单元素溶液标准物质钾（1 000 μg·mL-1）、钙（100 μg·mL-1）、钠（100 μg·mL-1）、镁（1 000 μg·mL-1）、铁（100 μg·mL-1）、锰（100 μg·mL-1）、铜（100 μg·mL-1）、锌（100 μg·mL-1）、葡萄糖标准品，中国计量科学研究院国家标准物质中心；没食子酸标准品（89.9%），中国食品药品检定院；槲皮素标准品（95%）、左旋抗坏血酸（SLBL9227V），Folin-Ciocalteu试剂、碳酸钠、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，2’-连氮基-双-（3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸） 二铵盐（ABTS） Sigma Aldrich公司；过硫酸钾，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；无水乙醇、硫酸、浓盐酸、苯酚，北京化工厂，为分析纯。

L-8900型氨基酸分析仪和紫外可见分光光度计U-3900，日本日立公司；Neixon350D型电感耦合等离子体质谱仪，美国PerkinElmer公司；Mars6-Express型高压微波消解仪，美国CEM公司；Spectra-Max i3x酶标仪，美国molecular devices公司；KQ-600DB型数控超声波清洗器（功率600 W，频率40 000 Hz），昆山市超声仪器有限公司。

1.2 牛肝菌氨基酸含量测定及氨基酸评分

称取牛肝菌样品约0.15 g于水解管中，用含0.05%巯基乙酸的盐酸溶液水解提取22 h，冷却后将水解液转移并定容至50 mL。吸取过滤后水解液1 mL于50℃水浴中浓缩至固体，用2.0 mL的0.02 mol·L-1稀盐酸复溶，过滤后测定。所有样品进行2次平行测定，结果以均值表示。氨基酸色谱条件参照参考文献[12]，并做适当处理；蛋白质含量的测定采用凯氏定氮法[13]。

氨基酸评分（AAS）[14]：将样品中必需氨基酸含量与世界卫生组织（WHO） 的参考蛋白质中必需氨基酸进行比较，比值最低者为限制氨基酸。限制氨基酸的比值乘以100，即为该样品的氨基酸评分（AAS），并与香菇、茶树菇和鸡菌等食用菌（干）的相应AAS进行比较。

1.3 牛肝菌矿物质元素含量测定

矿物质元素含量测定采用电感耦合等离子体质谱法[15]，称取0.3 g样品与硝酸6 mL～8 mL混合于消解罐中冷消化，过夜。消解完成后自然冷却至室温，在电热板加热至120℃～160℃，开盖赶酸至剩余溶液1 mL左右，冷却后用去离子水转移并定容至25 mL，摇匀，供上机备用，同时做试剂空白试验。仪器采用最佳技术参数与设定值，其中等离子体RF功率：1 500 W；冷却气氩气流速：15 L·min-1；雾化器氩气流速：1 L·min-1；辅助气体流速：1.2 L·min-1；采样深度：6.4 mm；进样稳定时间：15 s；泵速：30 r·min-1；重复次数：3 次。

1.4 牛肝菌多糖提取及含量测定

采用超声波提取法最佳工艺[16]提取5种牛肝菌多糖。每种样品称取1 g粉末，按照料液比1∶30加入蒸馏水，超声温度50℃、超声25 min后4 500 r·min-1离心吸取上清液，加入无水乙醇至终浓度70%沉淀多糖，4℃过夜，4 500 r·min-1离心弃上清，无菌蒸馏水定容至25 mL，即为牛肝菌多糖提取液，于4℃保存备用。采用苯酚-硫酸分光光度测定法，测定牛肝菌多糖含量。

1.5 牛肝菌多酚提取及多酚含量测定

采用超声波提取法最佳工艺[4]提取5种牛肝菌多酚。每种样品称取1 g粉末，按照料液比1∶44，加入85%的乙醇溶液，超声38 min后4 500 r·min-1离心15 min，吸取上清液并用85%乙醇溶液定容至50 mL，即为牛肝菌多酚提取液，于-20℃保存备用。采用Folin-Ciocalteu比色法测定多酚含量，在96孔板上分别加入 30 μL的多酚提取液样品、150 μL Folin-Ciocalteu试剂（0.2 mol·L-1）和120 μL碳酸钠溶液（75 g·L-1），室温暗处反应2 h后，在酶标仪于760 nm下测定吸光度，以没食子酸（8.75 μg·mL-1、17.5 μg·mL-1、35 μg·mL-1、70 μg·mL-1、140 μg·mL-1、280 μg·mL-1）为对照品绘制标准曲线，获取多酚含量以每克食用菌中没食子酸当量计。

1.6 牛肝菌多酚DPPH·清除能力检测

取15 μL多酚提取液于96孔板中，每孔加入225 μL DPPH（0.02 mg·mL-1），室温避光反应15 min，于517 nm测吸光度值，以乙醇代替样品溶液做空白对照，采用抗坏血酸 （5 mg·L-1、10 mg·L-1、20 mg·L-1、30 mg·L-1、40 mg·L-1、50 mgL-1）做为阳性对照绘制标准曲线，以抗坏血酸当量AEAC（antioxidant equivalent ascorbic acid content，AEAC） 计算多酚含量，同时计算1 g食用菌提取的多酚对DPPH·清除率（E1，%），计算公式为：

式中：OD1为空白吸光度；OD2为样品吸光度。

1.7 牛肝菌多酚ABTS·清除能力检测

分别配制ABTS溶液（7.4 mmol·L-1）和过硫酸钾溶液（2.6 mmol·L-1），将二者等体积混合，暗处、室温静置16 h后，用PBS（pH 7.4） 稀释合适比例（约10倍左右），调制成734 nm波长下吸光度为0.700±0.010，即为ABTS·工作液。取50 μL多酚提取液于96孔板中，每孔加入200 μL ABTS·自由基工作液，室温避光反应6 min，于734 nm测吸光度值，以乙醇代替样品溶液做空白对照，采用抗坏血酸 （5 mg·L-1、10 mg·L-1、20 mg·L-1、30mg·L-1、40 mg·L-1、50 mg·L-1）做为阳性对照绘制标准曲线，以抗坏血酸当量计算多酚含量，同时计算1 g食用菌提取的多酚对ABTS·清除率（E2，%），计算公式为：

式中：OD3为空白吸光度；OD4为样品吸光度。

2 结果

2.1 牛肝菌氨基酸测定结果

5种牛肝菌样品氨基酸测定结果见表1。

表1 样品中蛋白质和氨基酸含量分析结果Tab.1 Analysis results of protein and amino acid content in samples

由表1可知，5种牛肝菌氨基酸总量平均为16.62 g·100-1g-1，必需氨基酸平均为 7.904 g·100-1g-1，占氨基酸总量的47.400%，其中谷氨酸含量最高，达到2.679 g·100-1g-1，天冬氨酸、缬氨酸、亮氨酸和丙氨酸含量也较高。美味牛肝菌氨基酸含量最高（25.910 g·100-1g-1），是黑牛肝菌氨基酸含量（12.120 g·100-1g-1）的2倍。

根据必需氨基酸与参考蛋白质中必需氨基酸的比值，确定异亮氨酸为限制氨基酸，计算出牛肝菌的AAS，见表2。

表2 牛肝菌的氨基酸评分Tab.2 Amino acid score of Boletus spp.

由表2可知，样品中必需氨基酸总量达到377.98 mg·g-1，高于 WHO蛋白标准模式（315.00 mg·g-）1，即为优质蛋白。牛肝菌的AAS平均为81.3。与其他食用菌的氨基酸含量比较结果见表3。

由表3可知，美味牛肝菌的必需氨基酸含量为12.580 g·100-1g-1，高于茶树菇和鸡菌等食用菌的相应氨基酸含量。

2.2 牛肝菌矿物质元素含量测定

表3 牛肝菌、美味牛肝菌与其他食用菌比较Tab.3 Comparison among Boletus spp.,Boletus edulis and other edible fungi

采用检测灵敏度高、强势的抗干扰能力和快速分析结果的ICP-MS法分析5种牛肝菌的矿物质元素，包括钠、镁、钾、钙、铁、锌、锰、铜8种元素，结果见表4。

表4 5种牛肝菌矿物质元素含量Tab.4 Mineral elements of five varieties of Boletus spp.

由表4可知，每100克牛肝菌样品中，锌元素平均含量最高（55.580 0 mg）；钾、铁、钠、镁、钙、锰和铜的含量分别为50.000 0 mg、17.300 0 mg、8.220 0 mg、4.840 0 mg、1.400 0 mg、0.974 0 mg和0.099 8 mg，其中锌和铁含量明显高于香菇、茶树菇，表明牛肝菌为富锌的健康食材，其中黄牛肝菌的锌含量（88.6 mg·100-1g-1）最高，白牛肝菌次之，黑牛肝菌锌含量最低，5种牛肝菌的矿物质元素含量存在差异。

2.3 牛肝菌多糖和多酚的含量测定

采用超声波法提取5种牛肝菌的多糖和多酚，结果见表5。

由表5可知，5种牛肝菌之间多糖提取率差异大，从高到低依次是黄牛肝菌、美味牛肝菌、白牛肝菌、红牛肝菌和黑牛肝菌；黄牛肝菌的多糖提取率最高为57.30 mg·g-1，是黑牛肝菌提取率（最低，12.16 mg·g-1）的4.71倍，近似第二位美味牛肝菌的2倍。而牛肝菌多酚提取率差异不大，从高到低依次是美味牛肝菌、白牛肝菌、黄牛肝菌、红牛肝菌和黑牛肝菌；美味牛肝菌和白牛肝菌多酚提取率接近，分别为9.45 mg·g-1和9.39 mg·g-1。另外，5种牛肝菌都具有DPPH·清除能力和ABTS·清除能力，其中美味牛肝菌的ABTS·清除能力最强，抗坏血酸当量达到9.58 mg AEAC·g-1，清除率为41.22%，美味牛肝菌的DPPH·清除能力略次于白牛肝菌，其抗坏血酸当量达到6.51 mg AEAC·g-1，清除率为19.45%。5种牛肝菌中，黑牛肝菌的多糖提取率、多酚提取率和多酚抗氧化能力最差。

表5 5种牛肝菌多糖、多酚提取率和多酚抗氧化能力检测结果Tab.5 Results of the extraction rates of polysaccharides,polyphenol and polyphenol antioxidant capacity of five varieties of Boletus spp.

多酚提取率与其抗氧化能力相关性分析见表6。

表6 多酚提取率和抗氧化功能的相关性分析Tab.6 Correlation analysis of polyphenol extraction rate and antioxidant capacity

由表6可知，多酚提取率与多酚的抗氧化能力呈显著正相关，相关系数是0.813 2～1.000 0。

3 结论

综上所述，5种牛肝菌在氨基酸含量、矿物质元素、多糖和多酚等方面均有差异，各有所长。牛肝菌富含谷氨酸、天冬氨酸等呈味氨基酸，这也是牛肝菌味道鲜美的原因，其中美味牛肝菌的氨基酸最丰富，明显高于其他4种牛肝菌。黄牛肝菌的微量元素锌含量最高，白牛肝菌次之。黄牛肝菌的多糖提取率最高，美味牛肝菌和白牛肝菌次之。美味牛肝菌和白牛肝菌的多酚提取率和抗氧化能力接近，均高于其他3种牛肝菌。5种牛肝菌中黑牛肝菌的氨基酸含量、锌含量、多糖和多酚提取率都是最低的，但是黑牛肝菌的钾含量最高。

针对云南5种常见野生牛肝菌干货进行基本营养成分分析，为牛肝菌作为食品加工原料时选择适宜品种提供参考，同时牛肝菌的抗氧化能力也为营养性、功能性菌类食品的研发提供了较大的发展空间。另外，需要进一步完善对牛肝菌其他营养成分的研究，系统全面地评价牛肝菌的营养价值，为合理开发牛肝菌市场价值提供理论依据。