近红外光谱技术用于清开灵颗粒七混浸膏中3 种成分含量的快速测定

黄江剑，吴斌，肖利颖，林嘉凯，刘顺国，陈红英

广州白云山明兴制药有限公司，广州 510250

清开灵颗粒是由多种药材提取浓缩后加入适量辅料制成的颗粒，课题组前期对清开灵颗粒成品的含量进行研究［1］，本文从生产过程出发，研究清开灵颗粒生产过程（清开灵七混浸膏）含量的快速测定方法。

清开灵颗粒七混浸膏是清开灵颗粒生产过程的中间体，是由板蓝根、栀子、金银花、胆酸等组方通过不同处理方式浓缩成相对密度的浸膏，含有栀子苷、胆酸及总氮，生产过程中常采用高效液相法及凯氏定氮法［2］测定含量。高效液相法虽然检验准确，但检测过程中使用大量污染环境的化学试剂如乙腈、甲醇；凯氏定氮法检测样品需要时间长，两者都具有明显的滞后性；而近红外（near-infrared，NIR）分析技术具有分析速度快、效率高、不损伤样品、成本低、无污染和便于实现在线分析等特点［3］，近年来被许多学者应用于含量的快速检测研究［4-8］，为此，本文采用近红外光谱技术建立含量模型，采用不同处理方法优选最佳含量模型，为清开灵颗粒实现连续生产提供技术支持。

1 仪器与试药

1.1 仪器

waters e2695 高效液相色谱仪（紫外检测器及蒸发光散射，美国Waters 公司）；KQ5200E 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Antaris Ⅱ傅里叶变换近红外光谱（ThermoFisherScientific 公司）；Sartorius BS110S 电子天平（德国赛多利斯公司）；V3.0THUNIR 化学计量学软件（清华大学）。

1.2 试药

胆酸对照品（批号：100078-201814）、栀子苷对照品（批号：110749-201901）均购自中国食品药品检定研究院；色谱甲醇、色谱乙腈、色谱冰醋酸（美国Merck 公司）；超纯水（自制）。清开灵颗粒七混浸膏（自编批号:01-79）由广州白云山明兴制药有限公司提供。

2 方法与结果

2.1 清开灵颗粒七混浸膏栀子苷、胆酸和总氮的含量测定

按照中国药典［2］收录的HPLC 及凯氏定氮仪检测方法进行含量测定，测定的含量作为测定真实含量。所测得的含量分布如图1。

图1 3成分含量分布图

2.2 近红外光谱数据采集

2.2.1 测试条件采用空气为参比，采用光谱透射法采集样品光谱图，每个样品平行测定3 次。设定测定参数为分辨率8 cm-1，背景扫描32 次，扫描光谱范围：10 000～4 000 cm-1，温度为20～25 ℃，相对湿度为50～65%。

2.2.2 样品的制备由于清开灵颗粒七混浸膏是浓缩的浸膏，密度较大，课题组对样品进行稀释：精密称定样品约2 g，置100 mL 量瓶中，加入水70 mL，超声处理（功率180 W，频率40 kHz）30 min，放冷，加水至刻度，摇匀，滤过，为样品液。

2.2.3 数据采集与处理取样品液加入2 mm 石英比色皿，按照“2.2.1”项下的方法对79 批样品进行近红外光谱采集。从采集光谱的79 批样品中，选取64 个样品组成校正集，剩余15 个样品为验证集。校正集与验证集的含量分布见表1。

表1 校正集与验证集样品含量分布表 mg/袋

在光谱的采集过程中，环境、仪器及测定条件等的细微差异可能导致光谱的变化，可以通过预处理消除此类影响，常见的预处理方法有卷积平滑、一阶卷积求导、二阶卷积求导、多元散色校正、标准正态变量变换和归一化法等［9］。本文应用THUNIR V3.0 软件对采集到的近红外光谱图进行预处理，并采用不同波段选择方法如相关系数法、迭代优化等方法对光谱进行优化，选择偏最小二乘回归法对样品的光谱数据与含量数据进行回归拟合计算，建立校正模型。

使用不同的预处理方法对图谱进行处理，结果见图2。

图2 清开灵颗粒七混浸膏不同预处理方法的近红外图谱

2.3 建立定量模型

应用清华大学分析软件THUNIR V3.0，采用决定系数（R2）、交叉检验的校正标准偏差（SECV）、校正标准偏差（SEC）和主因子数（LV）来评价模型的预测性能。其中，R2 越接近1，SEC 越小，则校正值与近红外预测值相关性越好［1］。

不同波段选择方法获得的栀子苷模型优化结果见表2。

表2 不同方法所建立的栀子苷的校正模型参数

从上述表得出，迭代优化波长选择2 的模型参数最好，决定系数最高，因此，选择其为最佳模型，最佳模型SEC 随主成分数变化图见图3，预测值与参考值的相关图见图4，预测值与参考值偏差图见图5。

图3 栀子苷最佳模型SEC随主成分数变化图

图4 栀子苷NIR预测值与参考值相关图

图5 栀子苷 NIR预测值与参考值偏差

由图4、5 可知，栀子苷最佳模型的参数为：波段选择方法为迭代优化波长选择方法2、LV为15、谱图预处理为一阶卷积求导、波段范围7 586.588～8 778.380、R2 为0.999 9、SECV 为0.657 1、SEC 为0.002 0。

同样，按栀子苷建模方法优化胆酸和总氮的模型，优化后的最佳光谱模型见表3。

表3 3成分最佳模型校正参数

2.4 校正模型的验证

将采集的15 批验证集原始光谱数据输入上述建立的最优校正模型中，预测3 种成分的含量即预测值，并与用HPLC、凯氏定氮法测定的真实含量进行比较；结果见图6。由图6 可知，NIR 所建模型预测栀子苷、胆酸、总氮的含量结果与HPLC、凯氏定氮法的测定结果接近，绝对平均偏差分别为0.5 %、1.3 %、0.6 %，表明建立的定量模型的预测性能均较好。

图6 3种成分预测值和真实值对比图

3 讨论

本文选取64 批清开灵颗粒七混浸膏为样品集，用不同的预处理方法和波长选择方法建立近红外光谱的校正模型，通过不同的参数来评价模型的预测性能，并对15 批验证集的样品进行预测分析。通过分析比较，预测结果与HPLC 和凯氏定氮仪法的测定结果接近，表明预测模型可以快速准确地检测出样品中栀子苷、胆酸、总氮含量，故本文建立的定量模型可作为清开灵颗粒七混浸膏含量测定的依据，可为清开灵颗粒实现在线检测、连续生产提供有力的技术支持。

然而，本研究只对浓缩后的清开灵颗粒七混浸膏进行数据采集，清开灵颗粒七混浸膏是清开灵颗粒生产过程的中间体，要实现连续生产、在线检测需对浓缩过程不同密度的样品进行取样检测，建立相对较全面的样品集，使得建立的模型更准确。