沉默CTHRC1调控p53介导的线粒体凋亡诱导乳腺癌MCF-7细胞凋亡

曾 健，蒋 斌，黄 果，陈 娟

乳腺癌是一种激素依赖性的高度异质性肿瘤，是女性癌症相关死亡的主要原因[1]，其早期极易漏检，而确诊时往往已是晚期，同时高度异质性使其预后较差[2]。胶原三螺旋重复蛋白1(collagen triple helix repeat containing-1，CTHRC1)是一种抑制胶原蛋白表达和增加细胞迁移的分泌蛋白，可参与肿瘤病理进程。研究[3]显示CTHRC1蛋白在乳腺癌组织高表达，并与乳腺癌不良预后相关；Lai et al[4]进一步表明CTHRC1可促进乳腺癌细胞增殖、侵袭与转移，并抑制凋亡，但并未阐明其具体分子机制。p53是一种抑癌基因，通过调控细胞生长、凋亡和DNA损伤修复等过程抑制肿瘤进程[5]。研究[6]表明CTHRC1可负调控p53表达，促进肝癌的进程。然而，沉默CTHRC1表达是否可通过上调p53表达而激活线粒体凋亡途径诱导乳腺癌细胞凋亡，目前尚未阐明。因此，该研究通过探讨CTHRC1沉默是否通过激活p53介导的线粒体凋亡途径诱导乳腺癌细胞凋亡，为临床靶向治疗乳腺癌提供更多理论基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器人乳腺癌MCF-7细胞株购自北京中国医学科学院基础医学研究所；DMEM细胞培养基和胎牛血清购自美国Gibco公司；shRNA CTHRC1干扰质粒及其阴性对照质粒、siRNA p53干扰质粒及其阴性对照质粒均购自广州锐博生物科技公司；LipofectamineTM3000试剂购自美国ThermoFisher公司；CTHRC1及GAPDH引物均由上海生工生物公司合成；RT-PCR试剂盒购自上海全式金公司；CCK-8试剂盒、Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒、胞质和线粒体蛋白质提取试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司；线粒体膜电位检测试剂盒(JC-10)购自北京索莱宝科技有限公司；CTHRC1抗体、PUMA抗体、Bax抗体、Bcl-2抗体、Apaf-1抗体均购自美国SANTA公司；caspase 3抗体、Cleaved- caspase 9抗体、Cytochrome C(Cyt C)抗体均购自美国CST公司；COX IV抗体购自美国Abbkine公司；GAPDH抗体购自英国Abcam公司；qPCR仪(VeritiTM96-well Thermal Cycler)购自美国ThermoFisher公司；酶标仪(Synergy H1 Hybriod Reader)购自美国BioTek公司；Western blot显影仪购自上海天能生物公司；流式细胞仪(BD CALIBUR)购自美国BD公司。

1.2 细胞转染取对数生长期人乳腺癌细胞MCF-7种于6孔板中，5×105个/孔，每孔加2 ml含10%牛血清DMEM培养基，置于37 ℃、CO2培养箱进行培养，待细胞贴壁后进行分组：blank组(不做任何处理)、sh-NC组(转染shRNA CTHRC1阴性对照质粒pGPU6/GFP/Neo-NC)、sh-CTHRC1组(转染shRNA CTHRC1干扰质粒pGPU6/GFP/Neo-CTHRC1)。当细胞融合度约达到80%时，按照LipofectamineTM3000转染试剂说明书进行转染操作，将shRNA CTHRC1阴性对照质粒和shRNA CTHRC1干扰质粒分别转染到MCF-7细胞中，转染48 h后，收集细胞样品检测CTHRC1 mRNA和蛋白表达情况。CTHRC1 shRNA干扰序列：5′-ATCCCAAGTATAAT GGGAT-3′; 5′-ATCTGGAGAGATCCAATAT-3′。

1.3 Real-time PCR检测收集各组细胞，采用TRIzol法提取细胞总RNA，分光光度法测量总RNA含量及纯度，并将RNA逆转录成cDNA，以cDNA为模板进行RT-PCR扩增。引物序列：CTHRC1，F：5′-TCATCGCACTTCTTCTGTGGA- 3′，R：5′-GCCAACC CAGATAGCAACATC-3′；GAPDH，F：5′-AAGATCAT CAGCAATGCCTCC-3′，R：5′-TGGACTGTGGTCATGC CTT-3′。PCR反应条件：95 ℃、10 min；95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，40个循环；94 ℃、15 s；60 ℃、1 min；95 ℃、15 min。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt方法计算CTHRC1相对表达量。

1.4 Western blot检测蛋白表达收集各组细胞，采用RIPA裂解液裂解细胞，12 000 r/min离心25 min，取上清液得到总蛋白样品，使用考马斯亮(G250)检测法测定蛋白浓度。取20 μg蛋白上样，进行SDS-PAGE凝胶电泳，接着转到PVDF膜上，脱脂牛奶室温封闭2 h，洗涤后加入一抗CTHRC1(1 ∶200)、caspase 3(1 ∶1 000)、Cyt C(1 ∶1 000)、PUMA(1 ∶500)、Bax(1 ∶500)、Bcl-2(1 ∶500)、Apaf-1(1 ∶1 000)、Cleaved-caspase 9(1 ∶1 000)、COX IV(1 ∶1 000)、GAPDH(1 ∶1 000)，4 ℃孵育过夜，次日PBST缓冲液洗涤后，加入羊抗兔或鼠二抗(1 ∶10 000)，室温孵育30 min，洗涤后加入显影液，采用Image-Pro Plus6.0软件进行灰度分析，以目的蛋白条带灰度值与对照组条带灰度值的比值为相对表达量。

1.5 CCK-8检测细胞活性取对数期各组MCF-7细胞种于96孔板，5 000个/孔，置于37 ℃、CO2培养箱分别培养12、24、48、72 h。每个培养时间点结束后每孔分别加入10 μl CCK-8，37 ℃继续培养4 h，用酶标仪在450 nm下检测吸光度(optical density, OD)值，最终以时间为横坐标，OD值为纵坐标绘制细胞增殖曲线。

1.6 流式细胞术检测细胞凋亡取对数生长期各组MCF-7细胞种于6孔板中，5×105个/孔，培养48 h后用胰酶轻柔消化得到单细胞，预冷PBS洗3次，加195 μl Annexin V-FITC结合液重悬浮细胞，再分别加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI，25 ℃避光孵育20 min后，采用流式细胞仪进行检测。

1.7 线粒体膜电位检测取对数生长期各组MCF-7细胞种于6孔板中，5×105个/孔，培养48 h后用胰酶将细胞消化成单细胞，按照线粒体膜电位试剂盒说明书加入1 ml 1×JC-10染色工作液，细胞培养箱中37 ℃孵育20 min，用预冷的1×JC-10染色缓冲液洗涤2次，200 μl 1×JC-10染色缓冲液重悬浮细胞，采用流式细胞仪进行检测。

1.8 线粒体和细胞质蛋白中Cyt C蛋白检测收集对数期各组MCF-7细胞，预冷PBS(pH 7.4)洗涤细胞2次，按照胞质和线粒体蛋白质提取试剂盒说明书，利用胞质提取缓冲液和线粒体裂解缓冲液分别提取胞质蛋白和线粒体蛋白，按照上述1.4实验步骤检测Cyt C蛋白表达情况。

1.9 sh-CTHRC1和si-p53共干扰实验将对数期MCF-7细胞种于6孔板，5×105个/孔，将细胞分组为NC组(转染shRNA CTHRC1阴性对照质粒和siRNA p53阴性对照质粒)、sh-CTHRC1组(转染shRNA CTHRC1干扰质粒)、si-p53组(转染siRNA p53干扰质粒)、sh-CTHRC1+si-p53组(共转染shRNA CTHRC1干扰质粒和siRNA p53干扰质粒)，采用LipofectamineTM3000将以上质粒转染至MCF-7细胞中，细胞转染48 h后收集细胞，按照上述1.6、1.4分别检测线粒体和胞质蛋白中Cyt C以及凋亡通路相关蛋白表达水平。p53 siRNA干扰片段：5′-GAATGAGGC CTTAGAGTTA-3′。

1.10 统计学处理所有数据均采用SPSS 22.0统计软件进行分析，本研究的连续数据以3个独立实验的表示。两组比较采用t检验，单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CTHCR1沉默对MCF-7细胞中CTHRC1 mRNA和蛋白表达的影响与blank组比较，sh-CTHRC1组细胞中CTHRC1 mRNA和蛋白表达水平均下降，差异有统计学意义(F=53.921、62.942，P<0.001)，而sh-NC组的CTHRC1 mRNA和蛋白表达水平无明显差异，见图1。表明成功干扰乳腺癌MCF-7细胞中CTHCR1表达。

图1 CTHCR1沉默后MCF-7细胞中CTHRC1 mRNA和蛋白水平检测

2.2 CTHRC1沉默对MCF-7细胞活性的影响CCK-8实验结果显示，与blank组比较，sh-CTHRC1组细胞在培养24、48、72 h时其增殖活性均被性抑制，差异有统计学意义(F=6.852、10.361、37.214，P<0.05)，见图2。表明沉默CTHRC1可抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖。

2.3 CTHRC1沉默后对MCF-7细胞凋亡的影响流式细胞术检测结果(图3A)显示，与blank组比较，sh-CTHRC1组细胞凋亡率性升高，差异有统计学意义(F=73.254，P<0.001)，sh-NC组细胞凋亡发生率无差异性，；Western blot实验结果(图3B)显示，与blank组比较，sh-CTHRC1组细胞中Cleaved-caspase3表达量升高，差异有统计学意义(F=53.921，P<0.001)，sh-NC组细胞中Cleaved-caspase3表达无差异性。表明沉默CTHRC1可促进MCF-7细胞凋亡。

图2 CCK-8实验检测各实验组细胞活性

2.4 CTHRC1沉默后对MCF-7线粒体膜电位及Cyt C蛋白胞内定位影响线粒体膜电位检测结果(图4A)显示，与blank组比较，sh-NC组细胞线粒体膜电位无变化，sh-CTHRC1组细胞线粒体膜电位下降，差异有统计学意义(F=49.911，P<0.001)。Western blot结果(图4B)显示，与blank组比较，sh-CTHRC1组细胞线粒体中Cyt C蛋白表达降低，差异有统计学意义(F=197.014，P<0.001)，而胞质中Cyt C蛋白表达升高，差异有统计学意义(F=123.412，P<0.001)。表明CTHRC1沉默可导致MCF-7细胞线粒体损伤并可能诱发线粒体介导的细胞凋亡途径。

2.5 CTHRC1沉默后对p53介导的线粒体凋亡途径相关蛋白表达影响与blank组比较，sh-CTHRC1组中p53蛋白表达升高，差异有统计学意义(F=60.714，P<0.001)，p53介导的线粒体凋亡途径相关蛋白Apaf-1、Cleaved-caspase 9表达上升，差异有统计学意义(F=42.331、57.683，P<0.001)，抑凋亡因子Bcl-2蛋白表达下降，差异有统计学意义(F=23.214，P<0.001)，而促凋亡因子Bax和PUMA蛋白表达上升，差异有统计学意义(F=44.075、35.237，P<0.001)，而sh-NC组细胞中Apaf-1、Cleaved-caspase9、Bcl-2、Bax和PUMA蛋白表达水平无差异变化。提示CTHRC1沉默可能通过p53介导的线粒体途径凋亡诱导MCF-7细胞凋亡。见图5。

2.6 CTHRC1和p53共干扰后对MCF-7细胞凋亡的影响与NC组比较，si-p53组细胞p53蛋白水平下调(t=40.401，P<0.001)，表明p53干扰成功(图6A)。细胞凋亡检测结果(图6B)显示，与NC组比较，si-p53组细胞凋亡率无差异(t=0.281，P>0.05)，而sh-CTHRC1组细胞凋亡率增加(t=38.852，P<0.001)；与sh-CTHRC1组比较，sh-CTHRC1+si-p53组细胞凋亡率又降低(t=13.990，P<0.01)，说明CTHRC1沉默诱导的MCF-7细胞凋亡依赖于p53蛋白。Western blot结果(图6C)显示，与sh-CTHRC1组比较，sh-CTHRC1+si-p53组细胞线粒体中Cyt C蛋白表达升高(t=21.723，P<0.01)，而细胞质Cyt C蛋白表达降低(t=65.129，P<0.01)。进一步表明CTHRC1沉默可激活p53介导的线粒体细胞凋亡途径进而诱导MCF-7细胞凋亡。

图3 CTHRC1沉默检测MCF-7凋亡率和凋亡相关蛋白表达

图4 CTHRC1沉默后检测MCF-7细胞线粒体膜电位和Cyt C蛋白表达

图5 CTHRC1沉默后检测p53介导的线粒体凋亡途径相关蛋白表达

图6 共干扰CTHRC1和p53后检测细胞凋亡率和Cyt C蛋白胞内定位

3 讨论

尽管医疗水平提高，乳腺癌早期临床检测和治疗策略有所改善，但乳腺癌患者的预后仍较差[7]，CTHRC1作为一种新的致癌基因，已被证实在乳腺癌中异常高表达[3]。Lai et al[4]利用荟萃分析310例乳腺癌患者进行CTHRC1的预后价值评估，发现CTHRC1与较差生存率密切相关，可以作为乳腺癌新的独立预后生物标志物。因此，可以探究CTHRC1在乳腺癌发生过程中的作用机制，为临床靶向治疗提供理论依据。本研究选用CTHRC1高表达乳腺癌细胞MCF-7，研究沉默CTHRC1表达对MCF-7细胞凋亡影响以及内在分子机制。当沉默MCF-7细胞中CTHRC1表达，细胞增殖活性抑制，提示CTHRC1沉默可能与抑制乳腺癌细胞生长有关联。

凋亡是一个细胞程序性停止生长和分裂的过程，特征是发生众多与酶相关的生化反应以及细胞结构发生特征性的形态学改变，结果是清除机体有害细胞，且对周围组织损伤最小[8]，细胞凋亡调控失败，体内受损细胞累积，容易导致癌症发生。细胞凋亡的启动依赖于一系列的半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶的激活，这些蛋白酶被称为caspases，分为两类，起始凋亡蛋白酶和执行凋亡蛋白酶[9]，凋亡机制一旦检测到细胞损伤，起始凋亡蛋白酶如caspase 9会从非活性状态下即前体-凋亡蛋白酶被激活，进而对执行凋亡蛋白酶前体如Pro-caspase 3进行切割，产生有活性的执行蛋白酶如Cleaved-caspase 3，激活内切酶导致DNA片段化和细胞骨架破坏等一系列引起细胞凋亡事件。在MCF-7细胞中沉默CTHRC1表达，细胞凋亡水平升高，进一步检测相关蛋白显示，Cleaved-caspase 9表达升高，caspase 3发生切割现象，说明CTHRC1的沉默可以引起起始凋亡蛋白caspase 9活化，进而活化caspase 3蛋白诱导凋亡发生。执行凋亡蛋白酶caspase 9参与哺乳动物细胞中线粒体起始的内源凋亡途径，这种形式的凋亡依赖于线粒体释放的凋亡因子其中最主要的是细胞色素C(Cyt C)[10]，当细胞受凋亡信号刺激时，Bcl-2家族蛋白中的促凋亡因子Bax从细胞质转移到线粒体外膜，与膜上的电压依赖性阴离子通道相互作用，线粒体膜电位下降，膜通透转变孔(MPTP)打开促进线粒体释放Cyt C到细胞质基质中，而Bcl-2家族蛋白中的抑凋亡因子Bcl-2抑制Bax功能阻止线粒体通膜道开启[11]，Cyt C被释放到细胞质中，会与凋亡因子Apaf-1结合，其N端的caspase招募结构域招募caspase 9，并促进其自身切割活化[12]。本实验结果显示，CTHRC1沉默后Bax蛋白表达升高，线粒体膜电位下降，Cyt C蛋白从线粒体高表达转移到细胞质基质中高表达，Apaf-1蛋白表达也升高，进一步说明CTHRC1沉默诱导MCF-7凋亡是依赖于线粒体起始的内源凋亡途径。

p53基因是关键的肿瘤抑癌基因， p53蛋白控制着机体重要的细胞进程，如DNA修复、凋亡、代谢、发育和炎症等[13]。P53蛋白作为转录激活因子可以促进其下游基因PUMA、Bax表达。本研究结果显示在MCF-7细胞中，CTHRC1沉默后PUMA蛋白和Bax蛋白表达均升高。细胞应激引起凋亡时，一方面p53直接与促凋亡因子Bax结合，诱导线粒体外膜通透性改变；另一方面PUMA抑制抗凋亡因子BCL-xL与p53蛋白结合，促进自由的 p53蛋白与Bax结合诱导线粒体介导的凋亡[14]。有研究[6,15]报道，在肝癌细胞中被乙肝病毒(HBV)激活的CTHRC1通过抑制p53蛋白促进癌细胞增殖。实验结果显示，CTHRC1沉默后，p53蛋白表达升高，说明CTHCR1在MCF-7细胞中发生了依赖于p53介导的线粒体凋亡。进一步实验表明，当CTHRC1和p53蛋白共干扰后，MCF-7细胞凋亡发生被逆转，Cyt C蛋白在线粒体中表达升高，说明p53的干扰阻止了线粒体外膜变化，抑制了凋亡的发生。

综上，本研究确定了shRNA沉默CTHRC1可以激活p53介导的线粒体凋亡，抑制乳腺癌细胞生长。然而，作为致癌基因CTHRC1如何调控p53基因转录表达目前还不知晓，本研究下一步将重点研究CTHRC1调控p53表达的机制，以期为解决乳腺癌预后性差提供新的靶点和解决方案。