免疫耐受在牛乳过敏中的研究进展

李 欣，程剑锋，文学方，马 鑫，陈红兵

（1.食品科学与技术国家重点实验室，南昌大学，江西 南昌330047；2.南昌大学 食品学院，江西 南昌330047；3.江西省科学院 应用化学研究所，江西 南昌330096；4.南昌大学 中德联合研究院，江西 南昌330047）

发达国家中约5%～15%的婴儿可能会发生牛乳过敏，但根据严格的诊断标准，婴儿期确诊的牛乳过敏发病率只有2%～3%[1-2]。牛乳过敏是儿童早期最常见的食物蛋白过敏症，据统计，出生后第一年发病率约为2%至3%，而花生、大豆、鸡蛋小麦的过敏率分别为0.8%、0.8%、0.6%和0.2%[3]。牛乳过敏的概率在出生后第一年达到峰值，并且随年龄增长慢慢消退[4-8]。在过去几十年中，儿童期哮喘和鼻结膜炎等过敏性疾病发病率增加[9]，总体而言，牛乳的过敏率与其他食物的过敏率都呈增长的趋势[10-11]。

大多数患有牛乳过敏的婴儿会在出生后一个月内、食用牛乳配方奶粉后一周内出现。大多数患者同时有两种症状：其中50%～70%有皮肤症状，50%～60%有胃肠道症状，20%～30%有呼吸道症状。在纯母乳喂养的牛乳过敏患儿中，严重特应性湿疹是主要症状[12-13]。

1 牛乳过敏的机理

牛乳过敏是由一种或多种乳蛋白引起的有害机体健康的免疫学反应[14]。牛乳过敏反应可包括3种免疫学机制：一是乳蛋白特异性IgE介导的过敏反应；二是非IgE介导的过敏反应（细胞毒性超敏反应和迟发性超敏反应）；三是IgE与非IgE介导的混合型过敏反应，其中牛乳过敏反应主要以乳蛋白特异性IgE介导的过敏反应为主[14-15]。

IgE介导的牛乳过敏的发展分两个阶段发生。首先是“致敏”：免疫系统首次接触乳蛋白并产生针对乳蛋白的IgE抗体，这些抗体附着在肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面，使机体处于致敏状态。之后是“激发”；细胞相关的IgE结合乳蛋白上的过敏原表位，并引发强力炎症介质快速释放，导致过敏症状发生[14]。

非IgE介导的牛乳过敏反应主要包括以下3种类型：由IgG或IgM介导，补体、吞噬细胞和自然杀伤细胞引起细胞溶解和组织损伤的II型超敏反应；由IgG介导，补体和血小板、嗜碱性粒细胞、中性粒细胞引起充血水肿、血管炎性反应和组织损伤的III型超敏反应；由T细胞介导，单核/巨噬细胞和淋巴引起的炎症和组织损伤的IV型超敏反应[16-18]。IgE和非IgE介导的反应并不相互排斥，对牛乳的反应可能涉及免疫机制的混合[19]。

IgE介导的反应常见于婴儿期，非IgE介导的反应在成人中占主导地位。据报道，非IgE介导的牛乳过敏（与IgE介导的牛乳过敏相比）在儿童时期产生耐受的概率较高[20-22]。这表明非IgE介导的牛乳过敏群体在成年阶段出现概率比较高。

2 免疫耐受及相关的免疫细胞

食物免疫耐受是指机体免疫系统接触某种食物抗原后对该抗原的特异性免疫无应答，从而对该抗原不产生特异性免疫效应细胞及特异性抗体[23-24]。若食物过敏原采用特殊方式摄入，诱导免疫系统耐受，则治疗和预防免疫系统失调的过敏和其他非过敏性疾病（如自身免疫和器官移植）具有可行性[25]。免疫耐受主要受3种细胞调节：树突状细胞（DC）、调节性B（Breg）细胞、调节性T（Treg）细胞。

2.1 树突状细胞

在肠系膜淋巴结（MLN）中，来自固有层的迁移CD103+DC可通过多种机制促进肠道归巢Treg细胞的发育，进而产生耐受。CD103+DC产生转化生长因子-β（TGF-β）和视黄酸（来自维生素A），驱动Treg细胞分化[26]。CD103+DC的整合素分子avb8上调能刺激产生TGF-β，且能诱导小鼠在对肠抗原产生耐受的过程中产生Treg细胞[27-28]。另外，CD103+DC可以表达吲哚胺2，3-双加氧酶，这是一种参与色氨酸分解代谢的酶。若抑制吲哚胺2，3-双加氧酶，会导致CD4+Foxp3+T调节细胞转化减少和T细胞增殖，有利于诱导Th1和Th17转化[29]，抑制耐受性产生。DC上的CD11b通过抑制幼稚T细胞向Th17细胞分化而促进口服耐受[30]。没有炎症信号，用抗原刺激脾CD11c+DC活化也会导致CD4+CD25+Treg细胞扩增，并诱导对确定抗原的耐受性[31]。

肠相关淋巴组织的DC产生视黄酸，与IL-6或IL-5协同作用，诱导IgA分泌；缺乏维生素A和视黄酸的小鼠，其小肠中缺乏IgA分泌细胞[32]。这些研究表明，来自DC和MLN间质细胞的视黄酸对诱导B细胞和T细胞中的耐受性反应非常重要。

2.2 调节性B细胞

通常认为：浆细胞通过产生抗原特异性抗体作用于免疫应答，且有助于诱导CD4+T细胞活化[33]。Breg细胞通过产生抑制细胞因子（IL-10、TGF-β和IL-35）抑制效应T细胞，从而在调节免疫应答中发挥作用[34]。

Breg细胞主要通过IL-10调节过敏性炎症和耐受的免疫反应[35]。产生IL-10的CD5+Breg细胞在肠系膜淋巴结中发挥作用，特别是在牛乳过敏原激发的小鼠模型中调节IgE介导的过敏反应[36]。CD9+B细胞通过IL-10抑制Th2和Th17的炎症，使气道炎症减弱、肺功能正常化，从而使哮喘模型小鼠的肺组织恢复良好的免疫平衡[37]。IL-4下调和IL-10上调会导致IgG4水平增加和IgE水平降低，其中IL-10可促进重链免疫球蛋白同种型转换为IgG4，IL-4则诱导重链免疫球蛋白转换为IgE[38]。通过检测IL-10过表达的B细胞，可发现B细胞诱导耐受的基本机制：B细胞可抑制树突细胞成熟、T效应细胞增殖和IgE产生，从而抑制过敏反应发生。此外，过表达IL-10的B细胞会产生抗炎IL-1受体拮抗剂和血管内皮生长因子，抑制促炎细胞因子产生[39]。

TGF-β是一种多效细胞因子，有促进伤口愈合、组织重塑及免疫调节等功能。更重要的是，它参与幼稚CD4+T细胞转变为Treg细胞的过程[40]。IL-35通过诱导Treg细胞增殖并抑制TH17反应在免疫抑制中起作用[41]。

此外，1型Breg（Br1）细胞转换为浆细胞时产生IgG4，IgG4是一种非炎症性免疫球蛋白同种型，可阻止IgE介导的肥大细胞和嗜碱性粒细胞脱颗粒[42]。过敏原特异性IgG4可能参与促进免疫耐受。Santos等[43]研究表明：与花生过敏患者相比，产生耐受的患者花生特异性IgG4与花生特异性IgE的比例更高。

2.3 调节性T细胞

Treg细胞在抑制Th2介导的炎症和维持免疫耐受中必不可少[44]。CD4+Treg细胞分为两类：天然型Treg（nTreg）细胞和诱导型Treg（iTreg）细胞。 在胸腺中T细胞成熟的正常过程中，CD4+Treg细胞分化成CD4+CD25+nTreg细胞；在特定刺激条件下，CD4+T细胞被激活产生CD4+iTreg细胞。iTreg有三种不同的亚组，（1）诱导性Foxp3+Treg细胞；（2）1型Treg（Tr1）细胞；（3）Th3细胞[45]。

Treg细胞能通过几种抑制机制控制食物过敏反应的致敏和效应阶段。Treg细胞可分泌抑制性细胞因子，如产生IL-10和TGF-β、抑制IL-2产生、下调抗原呈递细胞（APC）[46]。Treg细胞还通过对肥大细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞的作用来抑制过敏性炎症，在OX40-OX40配体的相互作用下通过细胞-细胞接触抑制FceRI依赖性肥大细胞脱颗粒[47]。DC细胞是Treg细胞介导的免疫耐受的靶标。DC细胞分泌CTLA-4（细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白）和LFA-1（淋巴细胞功能相关分子），Treg细胞（除了CD4+幼稚T细胞）优先聚集在这些DC周围并且下调DC上的CD80/86的表达。Treg细胞可抑制DC成熟和幼稚T细胞活化[48]。

CD4+CD25hiCD127lo/-nTreg细胞在健康个体中通过IL-10诱导产生耐受性DC，而在哮喘患者中，nTreg细胞诱导产生耐受性DC的效率低得多，这导致哮喘严重程度增加[49]。在哮喘的实验模型中，缺乏nTreg细胞导致DC介导的气道炎症增强[50]。

Foxp3敲除小鼠发生了与过敏性炎症相关的多器官炎症反应[51-52]。过继转移Treg细胞能抑制小鼠食物过敏模型中的过敏反应，并能控制Th2免疫反应[53-54]。与健康对照相比，IgE介导的食物过敏儿童的Foxp3表达显著降低[55-56]。

与Foxp3+iTreg不同，Tr1和Th3细胞不表达主调节因子的转录因子Foxp3。Tr1细胞的特点是：共表达CD49b和LAG-3表面标志物，并分泌高水平的IL-10[57]。而Th3细胞不表达Foxp3或CD25，但在其表面表达潜伏激活肽（LAP），且LAP能产生抑制性细胞因子TGF-β。在小鼠中用卵白蛋白诱导Th3细胞进行表皮免疫治疗，通过抑制TGF-β的产生进而抑制肥大细胞活化，以此预防过敏反应[58]。在牛乳过敏的口服耐受模型中，低聚果糖可诱导Th3细胞抑制过敏反应[59]。此外，Th3细胞能促进iTreg细胞发育[60]。

TGF-β不仅由Th3细胞产生，也由Foxp3+Treg产生，且表达表面分子GARP。Treg细胞表达表面分子GARP对诱导口服耐受至关重要[61]。 IL-6，IL-21和IL-35可抑制GARP在Foxp3+Treg细胞上的表达，从而抑制LAP和TGF-β。阻断IL-6途径可促进小鼠口服耐受[62]。过量IL-4也会抑制过敏原特异性Treg细胞的诱导，并在小鼠模型中引起肠道炎症[63]。

3 诱导免疫耐受在食物过敏中的应用

3.1 口服耐受

口服耐受（OIT）指：通过口服途径预先施用抗原，达到特异性抑制细胞和体液免疫应答的目的[64]。口服耐受在胃肠道中发挥作用。为维持口服耐受性，肠相关淋巴组织继续区分自身与非自身抗原，并识别可导致组织炎症或肠道疾病的病原体。当肠相关淋巴组织不能发挥功能时，该过程失效，导致口服耐受性丧失和不必要的过敏反应[65]。影响口服耐受诱导的因素包括：抗原剂量、抗原来源、宿主遗传信息、宿主正常菌群和宿主年龄[66]。

给予单次高剂量抗原或重复较低剂量后，小鼠可诱导口服耐受[67]。这两种形式的耐受性，分别称为高剂量耐受和低剂量耐受。高剂量的口服抗原可诱导淋巴细胞无能[68]或缺失[69]。高剂量耐受由淋巴细胞的无反应性介导，可通过CD8+T细胞受体连接发生，或通过T细胞上的共刺激受体（CD28）和APC上的受体（CD80和CD86）相互作用发生，而不存在由可溶性细胞因子（如IL-2）提供的共刺激信号[70]。低剂量耐受由调节性T细胞介导。除上述抑制性CD8+T细胞外，不同类型的调节性CD4+T细胞在抗原的口服耐受性方面发挥了重要作用[71-73]。

口服耐受性也可由携带NK1.1标记的肝相关淋巴细胞（NK1.1+T细胞）介导。通过肠上皮细胞后，抗原可能被吸收到毛细血管中，进入门静脉，并且在肝脏中免疫细胞可能对这些抗原产生耐受性，此现象称门静脉耐受。通过在大鼠中进行门腔分流证明了发生这种机制的可能性，它是一种绕过肝脏抗原加工的过程，此过程不会对可溶性蛋白质抗原产生耐受性[74]。通过结肠炎的实验模型可知：NK1.1+T细胞为耐受介质。NK1.1+T细胞的消耗加剧了这些动物的结肠炎症[75]。

尽管已证明了OIT对脱敏的临床疗效，但通过荟萃分析发现：进行全面的疗效评估缺乏充分数据，仍存在安全性问题，需进一步评估[76-80]。一般以口为主的症状，其副作用属轻度至中度，采用OIT治疗可行性较强[81-85]。而对较严重的过敏反应，如全身性荨麻疹/血管性水肿、喘息/呼吸窘迫、喉头水肿、反复呕吐，则效果不好。Skripak等[84]对牛乳过敏患者进行OIT治疗时，发现45.4%OIT人员的症状与剂量有关，而只有11.2%安慰剂人员的症状与剂量有关，且大多是轻度和口咽的症状。

3.2 舌下免疫疗法

舌下免疫疗法（SLIT）是将食物过敏原提取物留在口腔中2～3 min，然后吐出或吞咽。此法的原理是：过敏原与口腔黏膜中致突变的朗格汉斯细胞相互作用，从而诱导产生耐受[86-87]。此过程中，过敏原被类似朗格汉斯细胞的树突状细胞捕获在口腔黏膜内，随后树突状细胞成熟并迁移至近端引流淋巴结[88-89]。这些淋巴结形成了专门的微环境，通过产生封闭性IgG抗体（小鼠中的IgG2b）并诱导具有抑制功能的T淋巴细胞，有利于诱导黏膜耐受性[90-91]。最终，由于过敏原特异性活化的效应T细胞在体内进行循环并且产生的记忆细胞存活时间足够长，在脱敏过程中局部（即舌下）施用过敏原会导致全身和黏膜保护性免疫应答。与OIT相比，SLIT通常能获得更好的治疗效果，且治疗过程中需要的过敏原剂量更低，但脱敏的临床效果较差[92]。

SLIT方案有两个阶段：建立阶段（在4至6周内逐渐增加剂量）和维持阶段（在几年内每周一次，最多3次给药），后者起决定性作用。用此方案开展治疗，给药后几天内会发生：促炎症细胞减少、IgG抗体上调和IL-10的产生[93]。几个月内会产生对Th1和Th2反应及适应性免疫的可检测影响[93]。通常情况下，免疫治疗后不久即可发现免疫学变化，但SLIT治疗至少1年后才对症状有效，在2年后才观察到最大益处[94]。但是，几种SLIT的急诊和超急诊方案已经证明：它可以在几周甚至几天内使皮肤反应性下降，并获得易于检测的临床获益[93,95-96]。SLIT诱导的免疫调节作用的持续时间少有报道，但几项独立研究表明：患有鼻结膜炎的儿童对草花粉或屋尘螨的SLIT可预防哮喘及新的过敏反应[94，97-98]。Rienzo等对SLIT进行了长达10年的随访，推测此法基于免疫记忆机制[97]。

大量临床经验证实：成人和幼儿对SLIT的耐受性都很好[99-101]。副作用通常发生在局部，包括口腔瘙痒、肿胀和刺激，且通常在给药后数分钟内发生，推测可能是IgE介导的反应。因SLIT期间炎症标记物（如类胰蛋白酶）不会局部增加，舌下接收过敏原刺激后，口腔中发生的IgE介导反应通常受到限制[102]。另外，在人体中进行的变应原实验已证实：舌下黏膜的反应性至少比鼻黏膜或皮肤低10倍[103],可能是因为口腔黏膜中促炎症细胞（如肥大细胞）较少。

尽管SLIT功效与过敏原剂量明显相关，但高剂量方案未显著提高全身或局部不良事件的发生频率[104]。在体外，高剂量的过敏原在诱导肥大细胞释放促炎症介质中的作用不如低剂量[105]。对于治疗哮喘和过敏性鼻炎，SLIT可改善临床症状并具有良好的安全性[99,106-107]。

3.3 表皮免疫疗法

表皮免疫疗法（EPIT）用含过敏原的贴片激活皮肤朗格汉斯细胞，随后朗格汉斯细胞迁移至淋巴结并下调效应细胞反应[86,108-109]。动物实验表明：EPIT诱导Th2型应答下调，以重新平衡Th2/Th1[110]。EPIT可显著提高所有过敏原的特异性IgG2a水平，从而降低IgE/IgG2a[111]。

这种表皮脱敏过程需要完整的皮肤屏障，为使EPIT有效，皮肤上层必须具有完整性，这突显了最外层的皮肤免疫系统的重要性。角质形成细胞构成结构屏障，并参与皮肤免疫应答：角质形成细胞能产生和分泌多种免疫试剂，且反应迅速[112]。刺激后的表皮中TNF-α（肿瘤坏死因子-α）、IL-1α、IL-1β和GM-CSF（粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子）水平升高，共同促进朗格汉斯细胞分化并激活成表皮内树突状细胞[112]。角质形成细胞可产生趋化因子，是全身性免疫细胞的主要募集信号[113]。在表皮层水平上，丝聚蛋白是人皮肤角质层中表皮分化复合物的关键成分。特应性湿疹患者中已显示出丝聚蛋白功能丧失的突变[114-116]，并与过敏风险增加相关[117-121]。因此，旨在恢复屏障功能的疗法不仅在特应性湿疹治疗中发挥作用，也在预防过敏性疾病的进一步发展中发挥作用[121]。

与其他免疫疗法技术相反，EPIT不需注射或口服过敏原，这是其安全性的基础。对18名牛乳过敏的儿童（年龄0.8～7.7岁）进行了为期3个月的双盲安慰剂对照试验[122]。治疗内容包括背部3遍48小时贴剂（脱脂奶粉作为活性物质），每周3次，几乎没有发生严重的全身性不良症状。这项试验表明EPIT是安全的，EPIT具有前两种方法无法比拟的优势。但是在花生过敏原的EPIT治疗期间却出现了持续副作用：局部红斑/湿疹，并持续数天可见，从而造成中途退出率接近20%[81-83，123-124]。因此表皮免疫疗法仍需要进一步完善。

4 展 望

食物过敏的根本解决方法是使机体产生免疫耐受，而非避食过敏原。目前对于免疫耐受的机制研究还不完善，且过敏个体差异性大，需进一步完善免疫耐受的机制，结合诱导剂诱导个体产生免疫耐受。将诱导免疫耐受的机制引入到低致敏的奶粉研发中，既可保证奶粉的食用安全性，又可使牛乳过敏人群从中获得较全面的营养素，这应是未来开发相关低致敏产品目标。