基于物质基准和传统用法的藏药四味姜黄汤散的工艺优化

周邦华，石 懿，余丽琼，谭 荣，王 翔，赖先荣*

（1.凯里学院黔东南民族药综合利用工程技术研究中心，贵州凯里 556011；2.成都中医药大学，四川成都 611137）

藏医药理论认为，现代糖尿病及其并发症属于藏医“京尼萨库病”范畴［1-2］，四味姜黄汤散（藏文名“勇哇西汤”）是藏医药治疗“京尼萨库病”的通治法方.该方由姜黄15 g、小檗皮12.5 g、余甘子和蒺藜各25 g 组成，具有清热，利尿功效，用于尿道炎、尿频、尿急等病症［3-4］治疗.赖先荣等已证实四味姜黄汤散煎浓汤（煮散）可通过调控链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病肾病大鼠血管内皮生长因子（VEGF）、转化生长因子-β1（TGF -β1），降低血清尿素氮（BUN）、肾指数等水平而发挥降血糖、肾损伤等保护治疗作用［5-7］.但笔者研究发现，四味姜黄汤散在西南六省区藏药标准及部颁标准中仅有性状、特征项目的描述，当今主要聚焦姜黄素［8］、没食子酸［9］等单一成分或多种成分［10-11］的含量测定或质量标准等的研究［12-13］，基于物质基准和传统用法的藏药复方标准汤剂［14-17］的研究尚未有报道.由于该制剂制备工艺不明确，质量不稳定，临床疗效不连续和患者顺服性差，影响了该方在藏医临床的推广及应用.鉴于此，本文借鉴现代中药复方标准汤剂（物质基准）和传统用法的提取技术，采用HPLC 法，以姜黄素量、盐酸小檗碱量、没食子酸量和干膏得率为指标，运用单因素试验、正交试验设计-综合评分法考察加水量、煎煮时间、粉末粒度和煎煮次数对四味姜黄汤散传统煎煮法工艺参数的影响，以期为藏药复方标准汤剂的制备和质量控制等后续研究提供参考.

1 试验仪器与试药

1.1 试验仪器

Agilent1260 型HPLC 色谱仪（美国Agilent 公司），KQ-50B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），CPA225D 型电子天平（德国赛多利斯公司），ULUP-I-10T 超纯水机（成都超纯科技有限公司），W201 恒温水浴锅（上海申顺生物科技有限公司），CH196电磁炉（广东格兰仕集团有限公司）.

1.2 试药

姜黄（批号20151101）为姜科植物姜黄Curcu⁃ma longa的干燥根茎、余甘子（批号20151101）为戟科植物余甘子Phyllanthus emblica的干燥成熟果实、蒺藜（批号20151101）为蒺藜科植物蒺藜Tribu⁃lus terrestris的干燥成熟果实，以上药材均购自成都市国际商贸城药材市场；小檗皮（批号20141201）为小檗科植物刺红珠Berberis kansuen⁃sis schneid根茎的干燥内皮，由西藏甘露藏药厂提供，以上药材均经成都中医药大学赖先荣教授鉴定.四味姜黄汤散按《部颁标准·藏药分册》的处方比例，粉粹过筛，混匀，即得3 批样品（批号分别为20151101，20151102，20151103）；没食子酸对照品（批号110831 -201204，含量89.9%计）；盐酸小檗碱对照品（批号110713 -201212，含量86.7%计）；姜黄素对照品（批号110823 -201004，含量98.8%计）均购自中国食品药品检定研究院，供含量测定用.磷酸、乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯.

2 试验方法与结果

2.1 四味姜黄汤散煎煮液的含量测定

2.1.1色谱条件

色谱柱：Capcell Pak C18-MGⅡ（4.6 mm×250 mm，5µm），流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～8 min，3% A～3% A；8～10 min，3%A～26% A；10～20 min，26% A～26% A；20～30 min，26%A～90%A；30～50 min，90%A～90%A），流速：1.0 mL·min-1，检测波长：265 nm（没食子酸、盐酸小檗碱）和430 nm（30～40 min，姜黄素），柱温：30 ℃，进样量：10µL，没食子酸、盐酸小檗碱和姜黄素理论塔板数不得低于5 000，5 000和4 000.

2.1.2对照品（混合对照品）溶液的制备

分别精密称取姜黄素、盐酸小檗碱和没食子酸对照品8.5，10.0，7.6 mg，置量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成姜黄素、盐酸小檗碱和没食子酸质量浓度分别为0.034，0.40，0.76 mg·mL-1的单一对照品贮备液.再精密吸取上述各对照品贮备液适量，于同一10 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成含姜黄素、盐酸小檗碱和没食子酸质量浓度分别为3.4，40，304 µg·mL-1的混合对照品溶液.用锡箔纸将已配好的量瓶包好，冷藏在冰箱中（4 ℃），备用.

2.1.3供试品溶液的制备

参考赵娅［11］HPLC 法同时测定四味姜黄汤散中7 种成分的方法并作适当调整，即量取按优化条件A2B1C3制备的四味姜黄汤散提取溶液适量于蒸发皿中挥干，加入盐酸-甲醇溶液（3∶100）溶解并稀释转移至50 mL 量瓶中，充分振荡摇匀，静置，滤纸滤过，滤液经0.45µm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液.按“2.1.1”项下色谱条件，分别精密吸取上述混合对照品溶液和供试品溶液10µL，注入液相色谱仪，记录色谱图，如图1.

图1 高效液相色谱图

2.1.4标准曲线绘制

分别吸取“2.1.2”项下混合对照品溶液，照“2.1.1”项下色谱条件2，4，6，8，10，12 µL 进样，记录其峰面积，分别以3 种对照品的进样量（x）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，3 种对照品的峰面积（y）与进样量（x）的线性关系考察结果见图2.结果表明3 种主要成分在其线性范围内，进样量与峰面积呈良好的线性关系.

图2 没食子酸、姜黄素和盐酸小檗碱标准曲线图

2.1.5精密度考察

分别吸取“2.1.2”项下混合对照品溶液，照“2.1.1”项下色谱条件，于同日内分别连续进样6次，每次10 µL，记录色谱峰面积，实验结果表明，姜黄素、盐酸小檗碱和没食子酸的RSD 值分别为1.89%、1.87%、0.37%，均小于2.0%，表明仪器精密度良好.

2.1.6稳定性考察

分别精密吸取同一提取条件下的供试品溶液，照“2.1.1”项下色谱条件，分别于制备后2，4，6，8，12，24 h进样10µL，记录色谱峰面积，计算RSD，实验结果显示，姜黄素、盐酸小檗碱和没食子酸含量的RSD 分别为1.88%、1.16%、0.90%，均小于2%，说明供试品溶液在24 h内稳定性良好.

2.1.7重复性考察

称取四味姜黄汤散样品适量，照“2.1.3”项下供试品溶液制备方法平行制备供试品溶液6 份，按“2.1.1”项下色谱条件下测定，记录色谱峰面积，计算RSD，结果姜黄素、盐酸小檗碱和没食子酸含量的RSD 分别为2.95%、2.39%、1.66%，RSD 均小于3%，表明该方法重复性良好.

2.1.8加样回收试验

称取同一已知含量的四味姜黄汤散粉末（2 次提取合并后测得盐酸小檗碱和没食子酸含量分别为3.315 mg/g，21.62 mg/g）9份，每份约10 g，分别按已知含量的50%，100%，150%三个水平加入盐酸小檗碱和没食子酸对照品适量，照“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样10µL，依次测定，计算回收率.按公式:回收率=（C -A）/B×100%计算即得.公式中，A 为供试品中所含被测成分量，B 为加入对照品量，C 为实测值，试验结果见表1.

表1 加样回收试验结果（n=9）

2.1.9含量测定

按处方比例取3 批四味姜黄汤散供试品，精密称定，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，并按“2.1.1”项下色谱条件，进样10µL，记录峰面积，计算含量，结果见表2.

表2 样品含量测定结果（n=3）

2.2 四味姜黄汤散煎煮工艺研究

2.2.1干膏得率的测定及综合评分计算

照《中国药典》2015 年版一部（附录XA）水溶性浸出物测定法试验，精密量取正交设计试验中各试验号的煎煮液25 mL，分别置于已干燥至恒重的扁平称量瓶中，水浴加热蒸干，于105 ℃电热恒温鼓风干燥箱干燥3 h，置干燥器中冷却30 min，迅速精密称定重量，前后两次称量小于5%，计算干膏得率（浸膏量/药材质量×100%）.

本实验根据各指标因素对提取工艺影响的贡献大小分配权重系数，即设定指标姜黄素、盐酸小檗碱、没食子酸和干膏得率的权重系数均为0.25，综合评分Y=（Y1/Y1max+Y2/Y2max+Y3/Y3max+Y4/Y4max）×0.25，其中Y为各试验号，Ymax为最高试验号.

2.2.2药材吸水率考察

按处方比例称取药材100 g（3 份），加10 倍量水，浸泡24 h，直至药材浸透心，滤过未被吸收的水液，称量湿药材，按如下公式计算药材的吸水率:吸水率=（药材浸泡后总重量-药材浸泡前总重量）/药材浸泡前总重量×100%，结果见表3，即吸水率为139.05%，约相当于约吸1.5倍量水.

表3 药材吸水率考察结果

2.2.3浸泡时间考察

按处方比例称取药材粉末100 g，加10 倍量水煎煮1次，考察浸泡1.0 h后煎煮和不浸泡直接煎煮两种提取方式对各指标的影响，结果见图3.可以看出浸泡时间对提取效果的影响呈先增大后基本保持不变的趋势，浸泡1.0 h 时，综合评分最大，且不再随浸泡时间的增加而增加（1.0～24.0 h），故浸泡时间选为1.0 h.

图3 浸泡时间对提取效果的影响

2.2.4煎煮时间考察

按处方比例称取药材粉末100 g，分别加10 倍量水浸泡1.0 h后煎煮0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 h，保持其他因素不变，考察不同煎煮时间对各指标的影响，结果见图4.由图4 看出，煎煮时间对提取效果的影响呈先增大后减小的趋势，煎煮2.0 h 时，综合评分最大，且随煎煮时间的增加先增大（0.5～2 h）后减小（2～6 h），考虑煎煮1.0 h的综合评分结果（0.92）和煎煮2.0 h 的评分结果（0.96）相当，为节约时间成本，故煎煮时间选为1.0 h.

图4 煎煮时间对提取效果的影响

2.2.5粉末粒度考察

称取过20，40，60，80，100 目的按处方比例制成的药材粉末100 g，分别加10倍量水浸泡1.0 h后煎煮1.0 h，保持其他因素不变，考察不同粉末粒度对各指标（姜黄素、小檗碱、没食子酸和干膏得率）的影响，结果见图5.可以看出，粉末粒度对提取效果的影响呈一直增大的趋势，粉末粒度100 目时，综合评分最大，且在20～100 目范围内随目数的增加而增大，故粉末粒度选为100目.

图5 粉末粒度对提取效果的影响

2.2.6加水量考察

按处方比例称取药材粉末（100 目）100 g，分别依次加8，10，12，14，16，18，20 倍量的水浸泡1.0 h后煎煮1.0 h，保持其他因素不变，考察加水量对各指标的影响见图6.由图6 看出，加水量对提取效果的影响呈先增大后减小的趋势，加量水14 倍时，综合评分最大，且随加水量的增加先增大（8～14 倍）后减小（14～20 倍），故加水量选14倍.

图6 加水量对提取效果的影响

2.2.7提取次数考察

按处方比例称取药材粉末100 g，分别加10 倍量水浸泡1.0 h 后煎煮1.0 h，各提取1，2，3 次，保持其他因素不变，考察提取次数对各指标的影响，见图7.从图7 可看出，第3 次提取时的综合评分为0.08，对提取效果的影响可忽略，故只需提取2次.

图7 提取次数对提取效果的影响

2.2.8正交试验设计

由单因素试验结果分析可知，第3 次提取时的综合评分为0.08，对提取效果的影响可忽略，故只需提取2 次即可；药材粉末浸泡1 h 后再煎煮时的综合评分最大，且综合评分不再随浸泡时间的增加而增大，故药材粉末只需浸泡1h 再煎煮即可.因此，本实验采用L（934）正交试验设计-综合评分法考察因素加水量（A）、煎煮时间（B）、粉末粒度（C）对指标姜黄素（Y1）、盐酸小檗碱（Y2）、没食子酸（Y3）和干膏得率（Y4）的影响.即按处方比例称取药材粉末100 g，置3000 mL 圆底烧瓶中，浸泡1 h 后进行回流煎煮，提取液趁热滤过（100 目滤布），提取2 次合并滤液，制成一定体积的提取液供测定，每组试验号重复3次，因数水平见表4，正交试验设计安排及结果见表5，方差分析见表6.

表4 因素-水平表

表5 正交试验设计安排与结果

表6 方差分析结果

由表5 和6 可知：R（C粉末粒度）＞RA（加水量）＞R（B煎煮时间），其中R值大小可用于衡量试验中相应因素对考察指标的影响大小，其中因素R（C粉末粒度）具有明显显著性，对提取效果影响最大，取极大水平值.因素RA（加水量）和R（B煎煮时间）之间的极差相差不大，对提取效果影响不具有显著性，可取极大值或者极限值.在综合考虑单因素试验结果以及直观分析正交试验极差结果的基础上，结合生产实际情况，故本实验选择A2B1C3预测组合进行验证试验，即称取处方粉末（100 目）适量，加12倍量水浸泡1 h后煎煮1 h，煎煮2次合并滤液.

2.2.9验证试验设计及结论

为了进一步验证正交试验预测结果A2B1C3的准确性，称取同一批次处方粉末约50 g，共3 份，每份按上述预测条件进行验证试验，结果见表7.可以看出验证试验的综合评分值均高于正交试验表中的每一项试验结果，表明A2B1C3的提取工艺条件是可行的.

表7 验证试验结果

3 讨论

汤剂是中医临床的传统用法，但其水煎耗时、质量难控的缺点降低了患者对中医药的认同感［14］.近年来，中医药的现代化加速出现了一些新的饮片用药形式，如超破壁饮片、配方颗粒等［15-16］，这些用药形式虽然丰富了传统饮片的内涵，解决了临床服用困难的问题，却脱离了组方合煎等中医用药理论，在提高了单味药成分溶出的同时，牺牲了因药物共煎而可能产生的临床疗效［17］.以陈士林、刘昌孝等为首的研究人员提出的中药饮片标准汤剂理论，为保障临床用药的准确性、疗效的一致性和用药的安全性提供了思路［18-19］.笔者认为，借鉴中药复方（饮片）标准汤剂（物质基准或Q -marker）的传统用法提取技术［18-23］，开展民族药特别是藏药饮片新形式、配方颗粒和复方标准汤剂的研究可能是未来藏医药的一个发展趋势，同时也是藏医药古代经典名方传承与创新的一次发展契机.

中药煮散是将中药材粉碎成粗颗粒或粗粉后，以水煎煮，去渣取汁或连同药渣服用的一种用药形式［24］.去渣煮散的物质基准应为滤掉药粉后的汤剂，而与渣同服煮散的物质基准为药渣和汤剂整体［25］.为了保持与临床使用形式的一致性，其物质基准的制备方法也应与临床实际形式相同［26-29］.笔者认为，在传统工艺优化中，藏药四味姜黄汤散的物质基准的制备应遵循以汤剂为物质基准的对应物，故本实验制备的提取液不再进行浓缩干燥制膏.

方中小檗皮的生物碱类成分盐酸小檗碱对糖尿病及DR、DN 等并发症具有显著的降糖效果，对微血管病变具有明显的改善作用，对糖尿病微血管病变密切相关的PPARs、PKC -β、HIF -1α、VEGF、Ang -2、ICAM -1 等细胞因子表达均有抑制作用［30-32］；姜黄的主要成分姜黄素可显著改善STZ 诱导糖尿病大鼠糖代谢紊乱，降低STZ 诱导糖尿病肾病的肾肥大指数，防止糖尿病肾病肾纤维化，增强机体抗氧化酶活性作用［33］；余甘子的成分没食子酸亦可通过调控胰岛素介导的PI3K/PKB/Glut4信号转导通路，发挥显著的降糖作用［34-35］.笔者认为，上述3 种成分均具有与该复方制剂功能相关的药理活性成分，皆是藏医临床治疗“京尼萨库”病（即糖尿病及其并发症）关键物质，因此选择上述成分作为客观评价物质基准的指标是有意义的.

综上，笔者认为，在中药标准汤剂为民族医药古代经典名方或药材饮片的标准化现代化研究提供一种新思路的同时，遵循民族医药理论的指导也是必须考虑的.