超声辅助提取荸荠皮中的总黄酮及抗氧化活性研究

李红侠，张慧慧，吴长昊，王 静，张瑞芳

（1.宿州学院，安徽宿州 234000；2.宿州市农业科学院，安徽宿州 234000）

荸荠Eleochairis tuberosa别名马蹄、地梨，属单子叶莎草科荸荠属［1］多年生宿根性草本植物，紫红色或者黑褐色，主要分布在我国长江流域以南各省份.

荸荠营养丰富，球茎富含淀粉，可生食也可熟食，味甘甜；也可供药用，民间常用来熬水治感冒、咳嗽，尤其皮中富含酚类、黄酮类等物质，是一种药、食价值很高的食物［2］.荸荠药用价值主要表现在消炎、抗癌、降压、抑菌、抗氧化等方面［3-7］，其中的活性成分主要集中在荸荠皮中.荸荠皮占鲜果重量的20%～25%，但在食用和加工时却被扔掉，很是可惜，因此，开发利用荸荠皮，提取荸荠皮中的活性物质不仅原料广泛，而且还解决了环境污染，具有一定的经济意义.

目前，对荸荠皮的研究不是很多，在荸荠皮成分提取中，抗氧化方面的研究更少，本次试验主要通过超声波辅助提取荸荠皮中的总黄酮，并对提取物进行抗氧化试验，以期为荸荠皮进一步深加工提供参考，为荸荠的实际利用提供理论依据.

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

荸荠皮（收集于安徽省宿州市南关菜市场），洗净晾干于恒温干燥箱45℃过夜烘干，粉碎，过60 目筛，备用.

1.2 试验仪器

超声波清洗器（JK⁃450B，合肥金尼克机械制造有限公司），循环水式真空泵（SHZ⁃DⅢ，上海鹏奕仪器有限公司），中药材粉碎机，扫描酶标仪（sun⁃rise，奥地利TECAN），紫外分光光度仪（TU-3310/760CRT，日本日立公司/上海精科），恒温干燥箱（上海合恒仪器设备有限公司）.

1.3 试剂

芦丁标准品（（纯度≥98%）和维生素C（上海源叶生物科技有限公司），乙醇（95%）、NaOH、NaNO2等均为分析纯.

1.4 试验方法

1.4.1制定标准曲线及测定总黄酮的得率

准确称取芦丁（干燥至恒重）标准品20.00 mg，溶解于80%乙醇中，移至100 mL的容量瓶，定容至刻度.用移液枪分别吸取0，1，2，3，4，5，6 mL 芦丁标准液，于25 mL容量瓶中，再对应加入10，9，8，7，6，5，4 mL的80%乙醇溶液于每个容量瓶中（每个容量瓶体积均为10 mL），然后向每个容量瓶中各加入5% NaNO2溶液700 µL，反应6 min 后，再依次加入700µL 10%A（lNO3）3溶液，摇匀后静置6 min，再依次加入5 mL 10%NaOH溶液充分摇匀，最后用80%乙醇溶液定容至25 mL，静置，15 min 后测吸光度（波长510 nm），平行测定3次.以芦丁标准溶液浓度为横坐标（x），吸光度为纵坐标（y），绘制标准曲线，得标准曲线的方程为y=0.017x-0.139，R2=0.998.

准确称取1.00克粉碎的荸荠皮细末，经乙醇溶液浸泡，超声提取，将所得提取液抽滤，即得含荸荠皮总黄酮的滤液.测定滤液的吸光度，根据标准曲线方程，求得相应总黄酮的浓度，计算荸荠皮总黄酮的得率［8］:A(%)=×100，式中C为对应总黄酮的浓度（mg／mL），V 为滤液体积（mL），A 为总黄酮的得率（%），m为荸荠皮样品质量（g）.

1.4.2单因素试验

在超声波条件下，以提取温度、提取时间、料液比、乙醇浓度为主要因子，研究各因子对荸荠皮中总黄酮提取率的影响.

分别称取4 组，每组5 份，每份1.00 g 荸荠皮粉末，分别倒入50 mL 的锥形瓶中，加入50%乙醇：第一组分别在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃，超声功率450 W，超声时间50 min；第二组按1：30 的比例各加入50%乙醇30 mL，超声功率450 W，温度60℃，提取时间分别为30、40、50、60、70 min；第三组分别加入15、20、25、30、35 mL 体积分数为50%的乙醇，设定温度为60℃的超声波清洗器中，超声功率450 W，提取时间50 min；第四组分别加入30 mL 体积分数为30%、40%、50%、60%、70%的乙醇溶剂，于60℃的超声波清洗器中，超声功率450 W提取40 min.然后各组过滤收集滤液，滤渣在同样条件下再提取，和并2 次的滤液，移入100 mL 容量瓶中，50%乙醇定容至刻度.分别用上述测取标准品的方法测各提取液的吸光度，计算总黄酮的提取率.

1.4.3正交试验设计

以超声波辅助下，乙醇溶液作为提取剂，筛选荸荠皮总黄酮提取的最佳组合条件，在单因素实验结果的基础上，对4 个因素进行优化组合，每个因素有3 个水平，采用正交设计，选用L（934），因素与水平见表1.

表1 正交试验因素与水平

1.4.4体外抗氧化活性的测试

1.4.4.1荸荠皮总黄酮对·OH自由基的清除能力［9］

取10 mL 的具塞比色管7 个，分别加入1 mL 0.75 mmoL/L 的邻二氮菲溶液、加PBS（pH7.4）3.8 mL，震荡摇匀，加1.5 mL 0.75 mmol/L FeSO4溶液，随即摇匀，接着往5 支比色管中依次加入不同质量浓度的荸荠皮总黄酮溶液1 mL，摇匀.剩余2 支一个为损伤管，另一个为未损伤管，不加样液.再分别加入0.01% H2O2溶液1 mL，未损伤管不加过氧化氢，加蒸馏水使体积至10.0 mL，水浴加热（37 ℃），时间30 min，在510 nm 处测其吸光度值.根据公式·OH 自由基清除率=［（A 样液-A 损伤）/（A 未损伤-A 损伤）］×100%计算，然后再以相同质量浓度Vc做阳性对照，计算清除率.

1.4.4.2清除DPPH自由基的能力［10］

取10 mL 的比色管5 个，分别加入3 mL 0.1 mmol/L 的DPPH 溶液和不同浓度的荸荠皮总黄酮3 mL，混合均匀，放置30 min.调零（用无水乙醇），在517 nm 处测定其吸光度记为Ai.同时测定3 mL无水乙醇和3 mL 不同质量浓度荸荠皮总黄酮的纯化液的混合液，517 nm 处的吸光度记为Aj，于此同时，测定3 mL 无水乙醇和3 mL DPPH 溶液的混合液在517 nm 处的吸光度记为A0.根据公式DPPH·自由基清除率=［1-（Ai-A）j/A0］×100%计算，然后用相同质量浓度Vc做阳性对照，计算清除率.

1.4.4.3清除O2-·自由基的能力［11-12］

取10 mL的比色管6个，分别加入Tris-HCl缓冲液（pH8.2）4.5 mL，在水浴（20℃）加热25 min.接着向其中5 个中依次加入1 mL 升不同质量浓度的荸荠皮总黄酮和0.3 mL 在30℃条件下预热的3 mmol/L 邻苯三酚（用10 mmol/L 的HCl 配制），充分摇匀后，水浴（20℃）6 mL，接着加入2 滴8 mol/L HCl 终止反应，测吸光度A（n波长320 nm）；用1 mL蒸馏水替代另1 支不加样液的试管，测吸光度A0.根据公式O2-·自由基清除率＝［（A0-An）/A0］×100%计算，再以相同质量浓度Vc 做阳性对照，计算清除率.

2 试验结果及分析

2.1 不同提取温度对荸荠皮总黄酮提取率的影响

由图1可知，当提取温度在30～60℃，随着温度的升高，荸荠皮总黄酮的提取率也增加，说明黄酮的溶解度在一定温度范围内，溶解度随温度的升高而增加，60℃时，总黄酮的提取率达到最大值，为2.27%，高于60℃时，提取率下降，可能是因为温度进一步升高，荸荠皮中的部分黄酮在乙醇溶液中分解，或结构遭到破坏，提取率降低，所以最佳温度选为60℃.

图1 提取温度对总黄酮提取率的影响

2.2 不同提取时间对荸荠皮总黄酮提取率的影响

由图2 可见，提取时间在30～60 min 时，总黄酮提取率随着时间的延长而增加，时间为60 min 时，总黄酮提取率最高，为2.03%.当时间进一步延长，超过60 min，可以看出提取率反而下降，也许在超声过程中伴随着一定程度的振动作用和空化作用，当超声时间增加到一定程度再继续增加，就会对总黄酮造成破坏，从而导致总黄酮的提取率下降，因此最佳提取时间应选择60 min.

图2 提取时间对总黄酮提取率的影响

2.3 不同料液比对荸荠皮总黄酮提取率的影响

由图3 可见，在液料比小于1∶35 时，荸荠皮总黄酮提取率随料液比的增加呈上升趋势，1∶35时荸荠皮总黄酮得率最大（2.12%），随后开始下降.可能是溶剂量的增加导致物料与溶剂的接触面以及溶液传质推动力均增大，浓度梯度增大，黄酮易于溶解出来，因而提取率增加；但溶剂增加到一定程度再加大，超声波的能量将消耗增加，那么超声的效率反而降低，细胞受击穿降低，有效物质的释放随之降低，导致提取率下降.所以，最佳料液比为1∶35.

图3 料液比对总黄酮提取率的影响

2.4 提取剂浓度对荸荠皮总黄酮提取率的影响

由图4 可见，总黄酮提取率随乙醇浓度递增呈现先增后减的变化态势，在乙醇浓度为50% 时提取率达到最大，为2.26 %，继续增加乙醇浓度，却引起总黄酮的提取率的下降.根据溶液的相似相溶性原理，当极性相近时溶解度增大，当乙醇浓度为50%时黄酮的极性与乙醇溶剂的极性最为接近，当乙醇浓度超过一定范围（大于50%），部分醇溶性的杂质成分溶出量也增加，影响黄酮类化合物的提取率，故乙醇浓度取50%.

图4 乙醇浓度对总黄酮提取率的影响

2.5 正交试验

在单因素试验的基础上，通过正交试验确定超声辅助乙醇浸提法提取荸荠皮总黄酮的最佳参数组合，结果见表2.

由表2可知，R值越大，说明该因素的变化对试验结果变动的影响越大，由此得出影响荸荠皮总黄酮提取的4个因素先后顺序为提取温度（A）＞料液比（C）＞乙醇浓度（D）＞提取时间（B）.

通过超声波辅助乙醇提取荸荠皮中的总黄酮最佳因素水平组合为A3B1C3D2，即超声温度60℃、超声时间40 min、料液比1∶35、乙醇浓度50%.进行3次优选平行实验，荸荠皮总黄酮的提取率分别是2.36%，2.42%，2.39%，平均值为2.38%，结果高于正交试验各组得率.

2.6 对·OH自由基清除率测定结果分析

·OH自由基较活泼而且具有较强的毒性，它能氧化机体内的脂质、蛋白质和核酸等大分子，引起人体组织的核酸断裂，脂质过氧化，蛋白质、多糖分解，导致机体衰老，基因突变甚至癌变［13］.由图5 可知，在浓度为50～600 µg/mL 时，对·OH 自由基清除率随着浓度的增加而增强，在相同浓度下，VC对·OH的清除能力略高于荸荠皮总黄酮，当荸荠皮总黄酮和VC 溶液浓度均为400µg/mL时，二者的清除率接近，分别为72.46%和68.35%.当荸荠皮总黄酮浓度为600µg/mL时，对·OH的清除率为87.35%.

图5 不同浓度的总黄酮和抗坏血酸对·OH 的清除率

2.7 对DPPH 自由基清除率测定结果分析

DPPH 自由基在C2H5-OH 溶液中颜色为深紫色，是较为稳定的有机含氮自由基，特征吸收峰为517 nm，当加入抗氧化剂时，它便与之中的氢结合，使颜色发生变化，因而吸光度值也跟着变化，因此可反应对自由基清除能力的强弱［14］.由图6 知，浓度在50～600 µg/mL 时，随荸荠皮总黄酮浓度的提高，对DPPH 自由基清除率增加.浓度在50～300µg/mL 时，荸荠皮总黄酮对DPPH 自由基清除率没VC 效果好，当浓度大于300µg/mL 时，荸荠皮总黄酮的清除率与VC 越来越接近，浓度达到600µg/mL时，与VC的清除能力接近.

图6 不同浓度的总黄酮和抗坏血酸对DPPH 的清除率

2.8 对O2-·自由基清除率测定结果分析

图7显示，荸荠皮总黄酮对O2-·清除率随着总黄酮浓度的增加而增大.当浓度为350 µg/mL 时，荸荠皮总黄酮和VC 溶液对O2-·清除率分别为90.26%和92.15%，较为接近，当浓度为400µg/mL时，总黄酮和VC 溶液对O2-·清除率分别为91.22%和93.78%，二者的清除能力几乎相当，VC是强的抗氧化剂，因此可以断定荸荠皮总黄酮同样具有较强的清除O2-·的能力.

图7 不同浓度的总黄酮和抗坏血酸对O2-·的清除率

3 结论

本试验通过采用超声波辅助法，进行荸荠皮中总黄酮的提取，试验结果显示：影响荸荠皮总黄酮得率的顺序为超声温度＞料液比＞乙醇浓度＞超声时间，最优组合为超声温度60℃、超声时间40 min、料液比1∶35、乙醇浓度50%，荸荠皮总黄酮的提取率为2.38%.抗氧化能力评估结果表明，荸荠皮总黄酮具有较好的清除·OH自由基、DPPH 自由基、O2-·自由基的能力.该试验结果对荸荠皮资源的有效利用及深度开发具有实际理论指导意义.