miR155调控TLR9信号通路对溃疡性结肠炎的影响

李艳荣，李岩，靳远，郭莲怡

(1.锦州医科大学附属第一医院，辽宁 锦州 121000；2.遵义医科大学基础医学院人体解剖学教研室，贵州 遵义 563000)

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种长期且易反复发作的慢性炎症疾病，发病机制复杂，常认为是遗传、免疫、肠道微生物等多种因素共同作用，主要表现为腹痛、腹泻、脓血便等症状。UC的病理表现主要为炎症和溃疡，发病于结肠黏膜及黏膜下层，可累及远端结肠及全结肠等部位。近年来，UC病发率不断增加，可引发结肠癌，为难治性疾病之一[1]。

炎症反应，为机体的防御系统，当受到微生物侵袭时，机体可通过炎症反应做出相应保护。UC患者存在的肠道菌群失调、感染等因素，可产生内毒素，而内毒素中的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)可刺激机体免疫系统，引发炎症反应。研究认为Toll样受休(toll like receptors，TLRs)与炎症反应密切相关[2]。TLR通过识别LPS，激活MyD88活化，诱导IRAKs磷酸化，进而激活TRAF-6，TRAF-6识别IKK复合体，进而导致NF-kB活化。活化的NF-kB可促进炎症因子表达，加剧炎症反应[3]。TLR9信号通路与肠道炎症密切相关，可影响肠道粘膜生理功能[4]。

microRNA为非编码小RNA，可在转录水平后抑制靶基因的表达或翻译。研究发现，miR-155为一种多功能基因，参与炎症、免疫等生物反应过程[5]。然而，miR-155是否通过调控TLR9信号通路影响溃疡性结肠炎，还需要进一步的研究与阐明。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级BALB/C小鼠20只，雄性，5～6 周龄，体重20～22 g，购自斯贝福(北京)生物技术有限公司(SCXK(京)2016-0002)。饲养于SPF级动物实验中心，相对湿度40%～60%，每日光照12 h，所有小鼠自由进食饮水。适应性喂养7 d。

1.2 建立UC模型及分组

采用含3%葡聚糖硫酸钠(DSS)饮水的方法建立UC小鼠模型。正常组小鼠10只予正常饮水15 d，UC模型组小鼠10只予含3%DSS饮用水连饮7 d，第8～15天予正常饮用水。

1.3 测定指标及方法

每天观察小鼠活动、饮水饮食等基本情况，用疾病活动指数(DAI)评估UC小鼠疾病状态(DAI计算方法见表1)；实验第14天晚上将小鼠禁食8 h，次日取材。眼眶取血，颈椎脱臼处死小鼠，置于冰上，从肛门上截取结肠标本，测量，记录长度；将结肠置于-80 ℃冰箱，用于后期的PCR和western blot实验。将血液标本离心，12 000 rpm，10 min，取上清，存于-80 ℃冰箱。采用ELISA法，按照试剂盒说明书，测定小鼠血清中炎症因子钙卫蛋白(calprotectin，CP)、IL-6、IL-1β、TNF-α等含量；比色法测定结肠组织髓过氧化物酶(MPO)活性。

表1 DAI评分方法

1.4 PCR检测指标及方法

取出结肠组织，用 RNA 提取试剂盒提取各组细胞中的RNA，逆转录合成 cDNA 后进行实时定量 PCR。使用 SYBR Green Real time PCR Master Mix 在 Roche Light Cycler 定量 PCR 仪上进行 PCR 检测，以 U6 为内参检测目的基因相对表达水平。PCR 反应程序：95 ℃预变性 30 s；95 ℃变性 30 s，62 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸 20 s，连续 40 个循环。miR-155 相对表达量用 2-△△Ct描述。 miR-155、TLR9、MyD88、NF-kB以及IL-1β、TNF-α、GAPDH等因子引物序，见表2。

表2 引物序列

1.5 western blot检测TLR9、MyD88、NF-kB蛋白表达情况

取小鼠结肠组织经 PBS 漂洗，组织裂解液提取总蛋白，聚丙烯酰胺琼脂糖凝胶电泳，将蛋白质转移至 PVDF 膜，TLR9抗体(1∶500)、MyD88(1∶500)NF-κB抗体(1∶1000)过夜(所有抗体购自Cell Signaling Technology，Boston，MA，USA)，TBST漂洗，孵育二抗，室温孵育1 h，TBST 漂洗，加入 ECL 暗室曝光，用 Image-J分析蛋白条带。

1.6 统计学方法

2 结 果

2.1 两组小鼠体重、DAI和结肠长度比较

采用3%DSS构建UC小鼠模型，发现UC小鼠体重逐渐下降，与正常组小鼠比较，有显著差异(P<0.05)；与正常组小鼠比较，UC小鼠DAI评分为(3.28±0.34)分，明显升高(P<0.05)；此外，UC模型小鼠结肠长度为(3.52±0.18)cm，明显低于正常组小鼠(7.05±0.37)cm，(P<0.05)，见图1、表3。

图1 结肠标本

2.2 两组小鼠结肠组织MPO活性比较

髓过氧化物酶(MPO)活性可间接反映小鼠结肠炎症水平。从实验结果发现，与正常组小鼠比较，UC模型小鼠MPO活性明显增加，见图2。

表3 两组小鼠体重、DAI和结肠长度比较

*与正常组比较，P<0.05

2.3 两组小鼠血清炎症因子CP、IL-6、IL-1β、TNF-α比较

采用ELISA法测定血清炎症因子表达水平。结果发现，与正常组比较，UC模型组小鼠CP、IL-6、IL-1β、TNF-α明显增加，提示UC小鼠炎症反应增强，见表4。

表4 两组小鼠血清炎症因子LPS、IL-6、IL-1β、TNF-α比较(pg/mL)

2.4 两组小鼠结肠组织miR-155、TLR9、MyD88、NF-kB以及IL-1β、TNF-α mRNA水平比较

如图3所示，与正常组比较，UC模型小鼠的miR-155、TLR9、MyD88、NF-kB、IL-1β、TNF-α mRNA表达明显增加。结果提示，UC小鼠免疫系统及炎症反应被激活。

2.5 两组小鼠TLR9、MyD88、NF-kB蛋白表达情况

与正常组比较，UC小鼠结肠组织TLR9、MyD88、NF-kB蛋白表达增加，提示TLR9信号通路可能参与UC的发生发展，见图4。

*与正常组比较，P<0.05

*与正常组比较，P<0.05

3 讨 论

UC发病率不断增加，该疾病持续发展可导致结肠癌。UC发病机制较为复杂，受多种因素的相互作用。目前，临床药物治疗仍然存在疗效不稳定、较易复发以及毒副作用较大等情况。因而，进一步研究UC的发病机制，或许为研发治疗UC的药物提供新的方向。UC患者普遍存在炎症反应失衡的问题，表现为促炎因子高表达，抗炎因子水平下降的情况，同时UC患者可检测到多种自身抗体，抗炎和抑制免疫反应从一定程度上改善UC患者的临床症状，说明免疫功能紊乱与UC发生发展密切相关[6]。IL-1β、IL-6、TNF-α为重要的炎症因子，钙卫蛋白(calprotectin，CP)来源于中性粒细胞，其表达具有组织或细胞特异性，是中性粒细胞更新的重要标志物。本文研究发现，UC组小鼠血清CP及结肠组织MPO水平明显高于正常组。

Toll样受体家族(Toll-like receptors，TLRs)为一种跨膜受体，具有识别病原微生物、促进抗菌基因表达及调控免疫反应等作用，在全身各器官具有表达[7]。UC患者肠道因肠道菌群的影响，导致急性损伤，进而引起相关信号通路的活化，促进NF-kB等因子的表达增加，加剧炎症反应，使UC疾病恶化。TLR9是TLRs家族的重要成员，特异性地识别并结合细菌 DNA中具有免疫刺激活性的非甲基化胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸序列(cytosine phosphate-guanosine，CpG)，进而激活小鼠的免疫细胞。TLR9在B细胞、树突细胞、单核细胞、T细胞及肠上皮细胞具有表达[8]。TLR9通过识别未甲基化CpG，募集MyD88，MyD88与IRAK结合，触动IRAK-1，进而导致IRAK-1从复合体上解离，且与TRAF6相互作用，使TRAF6活化，进而激活TAK1，导致IkB激酶磷酸化，使NF-kB释放并转移至核内。NF-kB活化可促进炎症反应，使IL-6、TNF-α的生成增加。研究发现，UC大鼠结肠组织高表达TLR9、NF-kB，且与疾病恶化程度相关[9]。本文研究发现，UC模型小鼠结肠组织TLR9、MyD88、NF-kB的mRNA和蛋白明显高于正常组小鼠，且UC小鼠血清中炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的含量明显高于正常组。提示，TLR9/NF-kB信号通路在UC发生发展中起着关键作用。

miR-155位于人类21号染色体上，其表达水平受B细胞整合簇基因(B-cell integrationcluster，BIC)转录水平和miRNA加工等调控。脂多糖(LPS)刺激单核细胞可导致miR-155表达增加，而miR-155抑制剂可通过细胞信号传导的抑制因子1(suppressor of cytokine signaling1，SOCS1)/ NF-kB信号通路下调LPS刺激的巨噬细胞的炎症反应。研究发现，在UC患者肌成纤维细胞(intestinal myelofibrosis，IMF)中 miR-155的表达明显高于正常患者，miR-155可以通过抑制SOCS1表达，调节IMF炎症表型，从而影响UC发生发展[10]。本文研究结果发现，miR-155在UC模型小鼠中的表达明显增加，同时伴随IL-1β、TNF-α及TLR9/NF-kB信号通路表达增强。提示，miR-155可能通过调控TLR9信号通路参与UC的炎症反应，抑制该信号通路可能为治疗UC的一个潜在靶点。