人参茎叶总皂苷对低蛋白诱导的宫内生长受限大鼠的保护作用

刘旭，单伟

(1.锦州医科大学附属第一医院重症医学科一病区；2.锦州医科大学基础医学院解剖学教研室，辽宁 锦州 121000)

宫内生长受限(intrauterine growth restriction，IUGR)是以新生儿出生体重低的方式表现出来[1]。据估计，其发病率约占妊娠的3%，并与围产期死亡率和严重发病率相关，并对成人生活中的神经发育和心血管健康产生不良影响。目前几乎没有预防或治疗IUGR的方法或药物。因此，减轻IUGR的发病率和影响在人类和兽医医学中都是迫切需要的。

IUGR不仅与营养不良有关，还与氧化应激有关，氧化应激会引发低度炎症。此外，IUGR胎儿的抗氧化防御系统被削弱，使氧化应激加重。人参具有抗肿瘤、抗辐射、抑制中枢疲劳、改善微循环等作用。此外，动物实验研究表明，人参茎叶总皂苷对小鼠肾损伤具有保护作用，其机制可能与改善氧化应激、减少炎症反应及抗细胞凋亡有关[2]。这些研究也许会为进一步研究人参茎叶总皂苷对治疗IUGR提供一些研究思路。所以，本研究的目的在于明确人参茎叶总皂苷是否对妊娠期低蛋白饮食诱导的IUGR具有保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SD大鼠，雄性和雌性只数按1∶2比例，体重200～230 g，由锦州医科大学提供[SCXK(辽)2017-0002]。

1.2 实验所用试剂及器材

人参茎叶总皂苷(纯度82 %，新宾药厂，批号20180312)，LC3和Beclin1抗体(上海生工生物有限公司)。IGF-1(Insulin-like growth factor 1)，GH(Growth hormone)，GHRH(Growth hormone releasing hormone)，SST(Somatostatin)，GSH(Reduced-glutathione)、INS(insulin)，T3(triiodothyronine)，T4(thyroxine)；SOD(Superoxide dismutase)、MDA(Malondialdehyde)等试剂盒均购于南京建成生物有限公司。

石蜡切片机(德国莱卡LEICA-RM2135)、流式细胞仪(美国BD公司FACS Calibur)酶标仪(中国DNM-9602G)、荧光化学发光凝胶成像系统(以色列MF-ChemiBIS3.2)、光学显微镜(OLYMPUS，bx60日本)等。

1.3 实验方法

1.3.1 模型制备及动物给药

动物分别在24 ℃和12 h的光照/暗循环下饲养3 d。雄性和雌性老鼠按1∶2的比例被放在笼子里。IUGR大鼠制备方法参照文献[3]。具体方法如下：妊娠大鼠立即分为以下3组(n=8)。以空白组为对照组，饲喂20%(w/w)蛋白饲料。模型组与人参茎叶总皂苷组妊娠第11～21天给予8%(w/w) 低蛋白日粮诱导IUGR。人参茎叶总皂苷在妊娠第11～21天灌胃给药，剂量为50 mg/kg。在出生后第1天，记录胎鼠体重、器官重量、每胎仔数、死亡率和畸形。取胎鼠血清样品，3000×g，离心15 min。

1.3.2 血清生化指标检测

胎鼠血清生化指标(SST、GHRH、GH、INS、IGF-1、T3、T4)水平采用双配体酶联免疫吸附试验(ELISA)，按照说明书测定。生化试剂盒检测SOD、GSH、MDA。

1.3.3 光镜分析

肝脏在4%多聚甲醛固定48 h。70%～95%乙醇1 h，100%乙醇为0.5 h 2次常规脱水，二甲苯透明，透明时间不固定，与组织块大小有关；浸蜡2次，最后进行包埋。石蜡切片机进行切片，厚度为5 μm。HE染色，组织形态学观察。切片用光学显微镜进行检查。

1.3.4 流式细胞仪器检测LC3和Beclin1蛋白的表达

取出肝脏，剪成0.5 cm小块，放进EP管，再将其剪碎，制备组织匀浆，过滤，离心取上清。加入LC3和Beclin1一抗，室温孵育30 min。PBS洗涤2次，加入带有Cy3标记的荧光二抗，孵育30 min。PBS洗涤2次。流式细胞仪激光管提前预热25 min，将仪器用荧光微球进行调整。空白标定为对照管，然后分析读取数据，记录标本LC3和Beclin1蛋白的表达。

1.4 统计学方法

2 结 果

2.1 新生仔鼠数量的变化

与空白组比较，模型组新生仔鼠数量减少，差异显著(P<0.05)；与模型组比较，人参茎叶总皂苷组新生仔鼠数量明显增加，见表1。

表1 各组新生仔鼠数量测定结果

2.2 新生仔鼠的体重、脏器指数比较

表2可以看出，与空白组比较，模型组仔鼠平均体重明显减少，差异显著(P<0.05)，肝脏指数比、小肠指数比明显增加(P<0.01)；与模型组比较，人参茎叶总皂苷组仔鼠的平均体重体现出明显增加，有显著差异(P<0.01)，小肠指数比、肝脏指数比明显减少(P<0.01)。

2.3 血清中生长发育相关因子检测结果

与空白组比较，模型组新生仔鼠血清中GHRH、GH明显增加，IGF-1、SST、INS、T3 和T4明显减少，差异显著(P<0.001)；与模型组相比，人参茎叶总皂苷组GHRH，GH明显减少，SST、INS、IGF-1、T3和T4明显增加(P<0.01)，差异显著(P<0.01)，见表3。

2.4 血清中抗氧化指标比较

与空白组比较，模型组新生仔鼠血清中SOD与 GSH明显减少，MDA明显增加，差异显著(P<0.01)；与模型组比较，人参茎叶总皂苷组SOD与 GSH明显增加，MDA明显减少，差异显著(P<0.01)，见表4。

表2 各组新生仔鼠体重、脏器指数、IUGR发生率比较

表3 新生仔鼠血清中GHRH，SST，GH，INS，IGF-1，T3 和 T4检测指标

表4 新生仔鼠血清中SOD，GSH，MDA的比较

2.5 肝脏形态学检测结果

空白组新生仔鼠肝脏肝索排列不规则。肝索与肝索之间可以看见肝血窦，在肝血窦里有血细胞存在。可见多边形或圆形的肝细胞，肝细胞与肝细胞之间界限不清晰。肝细胞大多数是一个核，细胞核圆，位于细胞的中央，肝细胞胞质丰富。此外，还可以看见与不同发育阶段肝细胞混合的髓样造血干细胞。造血干细胞成群存在，细胞核呈小球形、圆形、着色较深。模型组，造血干细胞和血细胞较空白组减少；与模型组比较，人参茎叶总皂苷组造血干细胞和血细胞增加，见图1。

2.6 肝脏LC3和Beclin1蛋白的影响

与空白组比较，模型组新生仔鼠肝组织中LC3和Beclin1表达明显增加，差异显著(P<0.05)；与模型组比较，人参茎叶总皂苷组LC3和Beclin1明显减少，差异显著(P<0.05)，见图2。

↓：髓样造血干细胞

图2 肝组织LC3和Beclin1蛋白的表达

3 讨 论

基础特征(新生仔鼠数量、死胎率和畸形率、新生仔鼠体重、脏器指数和IUGR发生率)、胎鼠血清生化指标、形态学指标表明，我们成功建立了IUGR的大鼠实验动物模型。对于治疗，人参茎叶总皂苷可以改善以上指标。提示人参茎叶总皂苷可能对IUGR大鼠有治疗作用。

IUGR能够改变下丘脑-垂体-肾上腺功能。生长激素(GH)是脑垂体前叶分泌的191种长链氨基酸激素，在促进长骨生长、调节糖脂代谢、肝功能代谢和能量平衡等方面发挥重要作用。生长激素释放激素(GHRH)和生长抑素(SST)均由下丘脑分泌。我们的实验显示，人参茎叶总皂苷降低了血清中GHRH和GH的水平，上升血清中SST水平。因此，我们认为在IUGR中，人参茎叶总皂苷的作用与GHRH/SST/GH有关。

生长激素的作用可以通过胰岛素样生长因子1(IGF-I)间接介导，IGF-I在肝脏和其他组织中产生。胎龄小的新生儿IGF-1、胰岛素(INS)水平明显低于胎龄适宜的新生儿[4]。与我们的实验结果一致。我们的实验结果显示，与模型组相比，人参茎叶总皂苷组血清中IGF-1和INS水平升高。结果表明，人参茎叶总皂苷影响IGF-1/INS通路介导的IUGR大鼠。

有研究表明，影响胎儿发育至关重要的因素是脂质信号和能量的来源，而子宫内脂质含量的改变主要是原因是甲状腺功能的减退[5]。胎儿组织的终末分化及一般组织的增生，会受到甲状腺激素的调节，为胎儿的体外发育做准备。IUGR婴儿出生时血浆T3、T4减少[6]。我们的结果显示，在IUGR中，T3和T4在出生时减少，人参茎叶总皂苷显著增加了T4、T3的比例，提示人参茎叶总皂苷促进了T4 、T3的产生。研究表明，人参原粉及人参水提物对正常成年大鼠的糖脂代谢及下丘脑-垂体-甲状腺轴无明显影响[7]。正常成年人参食用促甲状腺激素、T3、T4、睾酮和促肾上腺皮质激素水平均下降[8]。这些研究主要集中在正常成年动物或成人，但是还没有关于胎儿的报道。本研究未对母体激素进行检测，有待进一步研究。

适当的自噬被更广泛地认为是对抗各种环境因素的基本细胞生存机制，而过度激活的自噬是加速细胞死亡的级联反应。增强的自噬可能是IUGR胎儿重要的机制[9]。LC3对自噬活性至关重要[10]。此外，自噬体形成所需的关键信号元件Beclin1和作为降解泛素化底物的选择性自噬受体的p62也被用作自噬的标记物[11]。人参皂苷在不同的实验模型中对自噬有不同的影响。人参皂苷 Rg1抑制海马神经元异常自噬活动有关[12]。人参皂苷Rb1可以抑制阿霉素诱导的自噬相关结构增加等[13]。也有报道认为，人参皂苷Rg1处理组LC及Beclin 1蛋白表达水平显著上调[14]。我们的数据表明，人参茎叶总皂苷显著降低了自噬水平。其对自噬的影响与前人研究一致。这可能与IUGR中IGF-1信号的激活有关。这些推测将在今后加以研究。脂质过氧化作用于胎儿生长受限孕妇孕期明显增强[15]。超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶(SOD)为抗氧化酶的重要组成部分，丙二醛(MDA)为脂质过氧化产物之一。GSH 是体内主要的抗氧化剂。我们的数据表明，人参茎叶总皂苷显著拮抗了IUGR的氧化作用。

综上所述，本研究表明，人参茎叶总皂苷可能在IUGR大鼠中发挥有效作用。这些作用可能与增加甲状腺激素、GHRH/SST/GH、激活IGF-1/INS信号通路、抗氧化、减少自噬有关。