Treg细胞相关因子在重度慢性牙周炎中的表达

杨馨，王琳源，张文娟，张秀梅，高秀秋，关宁

(1.锦州医科大学口腔医学院；2.锦州医科大学附属第二医院牙周黏膜科；3.锦州医科大学基础医学院细胞生物教研室；4.锦州医科大学附属第一医院脑与脊髓损伤重点实验室，辽宁 锦州 121000)

慢性牙周炎(chronic periodontitis，CP)是一种由牙菌斑微生物引发的破坏牙周支持组织(包括牙龈、牙周膜、牙槽骨和牙骨质)的慢性炎症性疾病[1]。因其发病早期临床症状不显著容易被患者忽视，就诊时往往发展成为重度慢性牙周炎，出现牙齿松动或脱落。慢性牙周炎不仅是导致我国成人牙齿缺失的主要原因，而且与系统性疾病如动脉粥样硬化、糖尿病、类风湿性关节炎等关系密切，影响人们的全身健康[2]。造成慢性牙周炎的病因有微生物因素、宿主易感性以及环境因素等，慢性牙周炎病因的复杂性决定了疾病治疗的复杂性。虽然在临床上采用机械性清除菌斑、牙周组织再生手术以及一些辅助治疗措施在一定程度上控制和改善了病损区的牙周状况[3-4]，但对于重度慢性牙周炎，如何有效控制炎症进展，促进牙周组织修复仍是当前牙周研究的重点。近来越来越多研究证明慢性牙周炎是由宿主的免疫系统和牙菌斑中的微生物相互作用而产生的炎症性疾病，宿主对抗牙周致病菌的免疫应答影响着慢性牙周炎的炎症进展和组织损伤[5]。Treg细胞是一类具有调节功能的CD4+T亚群，在维持体内免疫耐受及调控抗原引发的免疫反应中发挥重要作用[6]。有关在重度慢性牙周炎中Treg介导的免疫应答情况尚未有相关报道。为此，在本研究中我们通过检测重度慢性牙周炎患者病损组织中Treg细胞相关因子Foxp3和IL-10 mRNA和蛋白表达，研究Treg细胞在重度慢性牙周炎中的表达情况。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

Marker(赛默飞公司，美国)；Foxp3抗体(Cell Signaling公司，美国)；IL-10抗体(Cell Signaling公司，美国)；β-actin(Bioss公司，中国)；羊抗兔二抗(EarthOx LLC公司，美国)；BCA蛋白测定试剂盒(鼎国昌盛公司，中国)；PVDF膜(GE公司，美国)；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(碧云天公司，中国)；HiScript II One Step RT-PCR Kit(Vazyme公司，中国)；100 bp DNA Ladder Marker(TaKaRa公司，中国)；Trizol(ambion，中国)；Foxp3引物合成(鼎国昌盛公司，中国)；IL-10引物合成(鼎国昌盛公司，中国)；DEPC水(鼎国昌盛公司，中国)。

1.2 样本采集和处理

收集2018年1月至6月期间，于锦州医科大学附属第二医院牙周黏膜科就诊并诊断为重度牙周炎，且无保留意义需要拔除的患牙15例，取患牙的牙龈组织作为实验组。同期收集15例因埋伏阻生需要拔除的第三磨牙，取冠方覆盖的健康牙龈组织作为对照组。

实验组纳入标准[7]：(1)探诊深度>6 mm；(2)附着丧失≥5 mm；(3)牙槽骨吸收超过根长的1/2；(4)炎症较明显，可伴有牙周脓肿；(5)后牙有Ⅱ度或Ⅲ度根分叉病变。诊断为重度牙周炎的患者需要2颗及以上患牙具有上述前3项特征；如仅有2颗患牙，这2颗患牙须不相邻，且至少位于不同象限。

健康对照组纳入标准[8]：(1)探诊深度<3 mm；(2)无附着丧失；(3)无牙槽骨吸收；(4)牙龈无炎症，探针不出血。

患者排除标准：(1)近6个月内接受过牙周治疗；(2)近6个月内服用抗生素，非甾体类抗炎药和免疫抑制类药物；(3)患有系统性疾病；(4)妊娠、哺乳期和正在服用避孕药的女性；(5)吸烟。

1.3 RT-PCR检测

1.3.1 RNA提取

Trizol法提取牙龈组织的RNA。紫外分光光度计测量RNA浓度及OD 值，样本260/280 nm OD比值均在1.8～2.2，记录总RNA 浓度，单位ng/μL。操作完成后，冻存于-80 ℃冰箱或直接进行PCR反应。

1.3.2 RT-PCR 反应

按照一步法反转录试剂盒(Vazyme，中国)配置25 μL反应体系，加入反应体系中RNA的量约为300 ng。反转录得到的cDNA进行PCR扩增。

引物设计：

Foxp3引物序列：

上游引物序列:5′-CAAGTGGCCCGGATGTGAGA-3′，下游引物序列5′- TGAGCGTGGCGTAGGTGAAAG-3′。扩增目的基因片段长度为440 bp。

IL-10引物序列：

上游引物序：5′-GACTTTAAGGGTTACCTGGGTTG-3′，下游引物序列：5′- TCACATGCGCCTTGATGTCTG-3′。扩增目的基因片段长度为112 bp。

以β-actin 为内参照物：

上游引物序列：5′-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT -3′，下游引物序列5′- GGGCACGAAGGCTCATCATT-3′。扩增目的基因片段长度为285 bp。

引物均由北京鼎国昌盛生物科技有限公司合成。反应条件为94 ℃，5 min；35个PCR循环(94 ℃，30 s；72 ℃，1 min)；最后72 ℃延伸7 min。PCR产物在2%琼脂糖凝胶分离，在凝胶成像系统内扫描后测量谱带强度。

1.4 western-blot检测

取出适量标本，室温融化，加入150 μL裂解液，反复吹打以充分裂解细胞，用BCA蛋白试剂盒测定蛋白浓度，经蛋白定量后按20微克/孔行10%聚丙烯酰胺(10%SDS-PAGE)电泳并经湿式转膜、洗膜、封闭后，取一抗稀释液(TBST液)按照1∶1000稀释Foxp3，IL-10抗体，4 ℃摇床过夜；洗膜后，再加入按照1∶10 000稀释的二抗，室温振摇孵育2 h，充分洗膜后，用ECL法显色、曝光后测量X光胶片上条带密度。

1.5 统计学方法

2 结 果

2.1 RT-PCR结果

我们采用RT-PCR法检测两组牙龈组织中Treg细胞相关因子Foxp3和IL-10的mRNA的表达情况。结果显示：Foxp3和IL-10的mRNA在健康牙龈组织和重度慢性牙周炎的病变牙龈组织中均有表达，并且重度慢性牙周炎组Foxp3和IL-10mRNA的表达水平高于健康对照组，差异显著(P<0.01)，见表1、图1、图2。

表1 两组中Foxp3、IL-10的mRNA表达及比较

N：健康对照组；P：重度慢性牙周炎组

图2 牙龈组织中Foxp3、IL-10mRNA表达**P<0.01

2.2 western-blot 检测结果

进一步，我们通过western-blot检测牙龈组织中Foxp3和IL-10的蛋白表达情况。结果显示：健康的牙龈组织有Treg细胞相关因子Foxp3和IL-10蛋白的表达。与健康对照组相比，重度慢性牙周炎组中Foxp3和IL-10的蛋白表达水平增高，差异显著(P<0.05)，见表2、图3、图4。

表2 两组中Foxp3、IL-10的蛋白表达及比较

N：健康对照组；P：重度慢性牙周炎组

图4 两组中Foxp3、IL-10的蛋白表达**P<0.01和*P<0.05

3 讨 论

慢性牙周炎是最为常见的一类牙周疾病。根据牙周袋深度、结缔组织附着丧失和骨吸收的程度分为轻度、中度和重度[9]。1990—2017年全球口腔疾病流行趋势的调查研究发现全球未经治疗的重度牙周炎发生率为79.0%，中国是重度牙周炎标准化治疗需求最高的国家之一[10]。慢性牙周炎发病的关键因素是牙周病原体形成的生物膜引发并导致牙周组织局部出现大量炎症介质为特征的免疫炎症反应，造成牙周病原体和宿主之间相互作用的失衡状态[11]。以往研究发现，慢性牙周炎患者牙龈组织与外周血中Treg细胞比例高于健康人群。提示Treg细胞在宿主体内的增殖与慢性牙周炎密切相关[12-13]。

Treg细胞可分为胸腺来源的自然Treg细胞(natual Treg，nTreg)和外周来源的诱导Treg细胞(induced Treg，iTreg)，部分CD4+胸腺细胞进行分化时，抗原呈递细胞所呈递的一些特异性抗原可诱导Foxp3分子产生，这类CD4+胸腺细胞分化产生的nTreg细胞表面可稳定持续表达Foxp3分子；外周幼稚T细胞受转化生长因子(transforming growth factor，TGF)-β的持续性刺激可分化为iTreg细胞，iTreg细胞表面Fopx3分子也可稳定持续表达[14]。在免疫稳态下，各器官中Treg细胞数量基本恒定，调控自身反应性T细胞活化与增殖，在确保自身免疫耐受的同时启动有效的免疫防御机制；在炎症反应中，T细胞受体(T cell receptor，TCR)介导的信号刺激引起Treg细胞增殖，发挥非抗原特异性免疫抑制作用，进而调控炎症程度[15]。研究发现，人X染色体连锁的先天免疫缺陷综合征(immunodysregulation，polyendocrinopathy，and enteropathy，X-linked syndrome，IPEX)与Foxp3蛋白编码基因突变有关，此外Foxp3蛋白及mRNA的表达情况还与银屑病、类风湿性关节炎等自身免疫病密切相关，提示Foxp3在Treg细胞的免疫调节功能中发挥关键性作用[16]。在本研究中，重度慢性牙周炎患者牙龈组织Foxp3表达高于健康人群，提示Treg细胞在慢性牙周炎的病损牙周组织中功能增强，参与炎症反应的免疫调控。

Treg细胞可通过分泌细胞因子IL-10、TGF-β等发挥免疫调节功能，其中IL-10是慢性牙周炎发病过程中的重要调节因子[17]。IL-10是参与感染调节过程的基本细胞因子，具有多效性，可来源于Treg细胞，调控Treg细胞的增殖，协助Treg细胞在慢性炎症的初始阶段抑制中性粒细胞和单核细胞激活并促进其凋亡，减少炎性细胞外渗，并可直接抑制辅助T细胞的作用，防止机体炎症过度活化及出现自身免疫症状[18-19]。Jiayin[20]等人通过对比慢性牙周炎患者与健康者牙龈组织中IL-10的表达情况发现，慢性牙周炎患者牙龈组织中IL-10表达增高，这提示IL-10在慢性牙周炎进展中可能起重要作用。程培红[21]等人在对慢性牙周炎患者进行基础牙周治疗后，菌斑微生物对牙周刺激减弱，IL-10表达水平持续升高，提示IL-10可能通过抑制促炎因子和趋化因子等炎性成分，为后续炎症修复和组织再生奠定良好基础，并在修复过程中起一定作用。与上述报道相一致，在本研究中我们发现Treg细胞相关因子IL-10在重度慢性牙周炎牙龈组织中的表达增高，提示Treg细胞通过分泌IL-10抑制牙周组织的炎症进程，进而促进组织修复。

综上所述，在重度慢性牙周炎的病损组织中，Treg细胞可能通过分泌抑炎性细胞因子IL-10参与炎症反应的调控。值得注意的是，尽管在重度慢性牙周炎牙龈组织中Treg细胞介导的免疫反应增强，但牙周支持组织病损并未得到有效控制，分析可能的原因如下：一方面是重度慢性牙周炎的病损微环境中除抑炎性细胞因子IL-10之外，还含有其他促炎性细胞因子如IL-6、肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor，TNF)-α等，促炎因子的高水平表达可能抑制了Treg细胞对免疫稳态的维持作用，削弱了Treg细胞的细胞效能[22]。另一方面虽然牙龈组织中Treg细胞表达水平增高，但一部分活化增殖的Treg细胞可能尚未发育完全，不能有效控制病原体，同时病损牙周破坏较为严重，发育成熟的Treg细胞所发挥的效能不足以有效控制炎症，导致炎症进展[23]。