干酪乳杆菌纯种发酵水苏糖合生元酸奶的菌种筛选与工艺

赵丽娜，巩俊明，张 娜，王妙姝，郑玮丽，康红艳，田洪涛，2*

（1 河北农业大学食品科技学院 河北保定071001 2 国家北方山区农业工程技术研究中心 河北保定071001 3 河北新希望天香乳业有限公司 河北保定071001）

水苏糖是存在于植物中的一种天然功能性α-低聚半乳糖，无任何毒副作用，通过可溶性膳食纤维及益生元双重作用改善胃肠道功能，对肠道益生菌有特异性的增殖作用[1-2]，并具有缓解便秘[3-4]，改善肠道菌群[4-5，7-8]，提高免疫功能[5]，降血糖[6-7]，保护肝脏[8-10]，抑制肿瘤细胞活性[11]等功能，被称之为“超强益生元”和“天然超强双歧因子”[12-13]。每天摄入0.5～3 g 水苏糖即可发挥益生功能[14]。与其它益生元相比，用量最低，为其它益生元产品的1/5～1/20[15]。水苏糖甜味纯正，甜度低，仅为蔗糖的22%，不被人体消化，性状稳定，高温酸性条件下较少分解，不与其它化学物质发生化学反应，也不影响其它物质的气味，是一种优良的功能性食品基料[16]，彻底克服了加工障碍，解决了以往益生元产品虽功效诱人但在产品中应用困难的问题[17]。

随着人们对益生菌、益生元、合生元保健功能的认识以及益生机理的不断揭示，益生菌、益生元、合生元的研究以及相关食品的开发成为目前食品领域研究的热点。目前我国关于合生元功能性乳制品的生产中，益生元的应用仍停留在“复配与添加”的层次上，益生菌发酵大多采用与传统酸奶菌混种发酵。由于发酵过程中传统发酵酸奶菌（保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌）抑制益生菌的发酵作用，因此益生菌的益生功能大打折扣。

益生元对益生菌的促生长作用具有菌种特异性。关于水苏糖促进特定益生菌的生长以及水苏糖-益生菌-传统发酵酸奶菌混种发酵合生元乳制品的研究已有报道，如：舒国伟等[18]研究了水苏糖对双歧杆菌生长的影响，魏艳等[1]研究了水苏糖对植物乳杆菌的增菌机制，王利红等[19]研究了水苏糖对保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌和双歧杆菌的混菌增菌效果，王庭欣等[20]研究了水苏糖、木糖醇对保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌混合菌株的增殖效果，季丽媛[21]研究了添加水苏糖的功能性酸羊乳发酵工艺，于静等[22]研究了含水苏糖的植物乳杆菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌混菌发酵酸奶工艺。然而，迄今尚未见水苏糖对干酪乳杆菌增菌效果的研究，也未有益生菌纯种发酵水苏糖合生元酸奶产品的报道。

筛选适宜利用水苏糖发酵的特定益生菌株，研究其纯种发酵水苏糖牛乳工艺，是研制水苏糖-益生菌合生元酸奶的关键技术。本研究初筛试验菌株发酵牛乳的能力，根据菌株利用水苏糖的增殖效果进行复筛，筛选发酵水苏糖功能性乳制品凝乳时间短、产酸能力强、感官风味和组织状态俱佳，并能利用水苏糖显著增殖的特异性益生菌菌株。在此基础上，测定菌株在纯牛乳基础培养基中的生长曲线，研究益生元增殖培养基中水苏糖的最适添加量，优化水苏糖-益生菌合生元酸奶的发酵工艺，研制出集水苏糖益生元和益生菌保健功能于一体的功能性合生元酸奶。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验菌株

1）新型益生菌：植物乳杆菌05-19、14-196、15-197、ST-III、07-191、Fs-1、Fs-2、Fs-3、Fs-4，鼠李糖乳杆菌05-28 和05-281，干酪乳杆菌05-20、05-21、14-212、07-211，瑞士乳杆菌05-29，罗伊氏乳杆菌05-27、05-272，均由本实验室自行分离选育。

2）商品化酸奶发酵剂菌株：保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌混合菌株、鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌混合菌株、鼠李糖乳杆菌和副干酪乳杆菌混合菌株、植物乳杆菌，由河北新希望天香乳业有限公司提供。

1.1.2 原料 全脂牛奶，购自北京伊利乳业有限公司；水苏糖，购自西安大鹏生物科技有限公司；蔗糖，市售白砂糖。

1.1.3 培养基

1）MRS 培养基：液体用于菌种的活化，固体用于活菌计数。

2）牛乳发酵培养基：全脂牛奶中添加质量浓度为40 g/L 的蔗糖，加热混合均匀后，100 ℃、10 min 灭菌，冷却至37 ℃备用，用于备选菌株发酵牛乳能力的测定。

3）纯牛乳基础培养基：全脂牛奶100 ℃，10 min 灭菌，冷却至37 ℃备用，用于菌株复筛和生长曲线的测定。

4）益生元增殖培养基：全脂牛奶中添加一定量水苏糖，混合均匀后，100 ℃，10 min 灭菌，冷却至37 ℃备用，用于菌株复筛和增殖培养基中水苏糖最适添加量的分析。

1.1.4 主要仪器、设备 CJ-INDII 超净台，北京东联哈尔仪器公司；ZXDP-A2080 生化培养箱，上海智城仪器分析公司；YXQ-LS-18SI/22L 手提式湿热灭菌锅，上海东亚压力容器公司；OHAUS Starter 2100 pH 计，奥豪斯公司；JA5002 电子天平（精确至0.01）、FA1004A 电子天平（精确至0.0001），上海精天电子仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株活化 将1.1.1 节的备选菌株21 株和酸奶发酵剂菌株1 株经液体MRS 活化，活菌数达到109CFU/mL 以上，备用。

1.2.2 根据发酵牛乳能力进行备选菌株的初筛将活化好的菌株以体积分数为3%的接种量接入1.1.3 节所述牛乳发酵培养基中，37 ℃恒温培养，至凝乳 （发酵12 h 未凝乳的取出），记录凝乳时间，4 ℃后熟12 h，测量pH 值、滴定酸度，进行感官品评。

1.2.3 根据水苏糖增殖效果进行初筛菌株的复筛将初筛菌株以体积分数为1%的接种量分别接入1.1.3 节所述纯牛乳基础培养基和水苏糖添加量为0.8%的益生元增殖培养基中，37 ℃恒温培养12 h，检测活菌数。

1.2.4 复筛益生菌在基础培养基中生长曲线的测定 将复筛菌株以体积分数为1%的接种量接入1.1.3 节所述纯牛乳基础培养基中，37 ℃恒温培养24 h，每隔2 h 定时取样，检测活菌数。以培养时间为横坐标，以对应活菌数的对数为纵坐标，绘制生长曲线，确定菌体生长进入对数末期或稳定初期的取样时间。

1.2.5 复筛益生菌在增殖培养基中水苏糖最适添加量的分析 将复筛菌株以体积分数为1%的接种量分别接入水苏糖添加量为0%，0.2%，0.4%，0.6%，0.8%，1.0%的1.1.3 节所述益生元增殖培养基中，37 ℃恒温培养，在对数末期及对数末期前后2 h 时取样品检测活菌数。

1.2.6 复筛益生菌纯种发酵水苏糖合生元酸奶工艺流程 纯牛乳→添加最适添加量的水苏糖、蔗糖→加热、混匀→100 ℃，10 min 灭菌→冷却至室温→接种→恒温发酵至凝乳→4 ℃后熟12 h→产品。

1.2.7 复筛益生菌纯种发酵水苏糖合生元酸奶工艺条件优化 复筛纯种发酵水苏糖合生元酸奶工艺条件优化，采用正交试验，各因素水平见表1。

1.2.8 复筛益生菌纯种发酵水苏糖合生元酸奶的质量检测 根据相关标准分别对0 d 和4 ℃贮藏21 d 的复筛益生菌纯种发酵水苏糖合生元酸奶进行质量检测。包括根据国标GB 19302-2010《食品安全国家标准 发酵乳》进行感官、理化指标、污染物限量、真菌毒素限量、微生物限量、乳酸菌数检测；根据中国医药保健品进出口商会团体标准T/CCCMHPIE 1.39-2018《植物提取物 水苏糖》对水苏糖含量进行测定。

表1 正交试验各因素水平表Table 1 Level table of each factor in orthogonal experiment

1.3 试验数据统计分析方法

试验数据采用SPSS Statistics 17.0 进行方差分析及多重比较。

2 结果与分析

2.1 根据发酵牛乳能力进行备选菌株的初筛

根据1.2.1 节和1.2.2 节试验方法，进行备选菌株发酵牛乳能力试验，结果见表2。

表2 备选菌株在牛乳培养基中发酵能力测定Table 2 Determination of fermentation ability of candidate strains in milk medium

（续表2）

由表2可见：只有保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌、干酪乳杆菌07-211、瑞士乳杆菌05-29 发酵的牛乳产品分别在4.0，4.5，10 h 凝乳，其它菌株发酵牛乳12 h 凝乳较差或未凝乳；保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌、干酪乳杆菌07-211、植物乳杆菌Fs-1、干酪乳杆菌05-20 发酵的牛乳产品产酸能力较强，pH 值在4.39～4.95 之间，滴定酸度在54.02～85.58°T 之间，与其它菌株发酵的牛乳产品呈显著性差异（P＜0.05）；感官评分项保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌、干酪乳杆菌07-211、瑞士乳杆菌05-29、植物乳杆菌Fs-1、植物乳杆菌14-196、鼠李糖乳杆菌和副干酪乳杆菌混合菌种发酵的牛乳产品感官评分及格，分别为8.5 分、8.3 分、6.9 分、6.2 分、6.2 分、6.2 分，其它菌株发酵的牛乳产品均在4.3 分以下，呈显著性差异（P＜0.05）。因此综合分析菌株发酵牛乳的能力，选择干酪乳杆菌07-211、瑞士乳杆菌05-29、植物乳杆菌Fs-1、植物乳杆菌14-196、鼠李糖乳杆菌和副干酪乳杆菌混合菌种作为初筛菌株进行下一步研究。

2.2 根据水苏糖增殖效果进行初筛菌株的复筛

根据1.2.3 节试验方法进行初筛菌株在纯牛乳基础培养基和水苏糖益生元增殖培养基中的生长比较试验，结果见图1。

图1 菌株在基础培养基和增殖培养基中发酵12 h 活菌数Fig.1 Viable counts of strains in basal medium and proliferation medium for 12 h

图1表明：在添加8%水苏糖牛乳增殖培养基中瑞士乳杆菌05-29 的活菌数显著下降 （P＜0.05），其它5 株菌的活菌数显著上升（P＜0.05），其中干酪乳杆菌07-211 的活菌数在基础培养基中为3.19×108CFU/mL 在增菌培养基中增长至2.05×109CFU/mL，差异极显著（P＜0.01），增菌6.43倍，增殖最多。

干酪乳杆菌07-211 发酵性能好且能利用水苏糖进行极显著增殖，属于能在人体肠道定殖的典型益生菌，而传统发酵酸奶菌（保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌）于人体肠道的“过路菌”，不能在人体肠道定植，其益生功能大打折扣。因此，确定干酪乳杆菌07-211 作为开发水苏糖-益生菌合生元酸奶产品最终复筛益生菌菌株。

2.3 复筛益生菌在基础培养基中生长曲线的测定

根据1.2.4 节试验方法进行复筛菌株干酪乳杆菌07-211 在纯牛乳基础培养基中生长曲线的测定，结果见图2。

图2显示：复筛菌株干酪乳杆菌07-211 在纯牛乳基础培养基中接种后经过短暂的调整期，快速进入对数生长期，活菌数呈极显著增长的趋势（P＜0.01），10 h 后活菌数变化不显著（P＞0.05），达到对数末期或稳定初期。因此，选取8，10，12 h 作为后续研究干酪乳杆菌07-211 在增殖培养基中确定水苏糖最适添加量的活菌数取样时间点。

2.4 复筛益生菌在增殖培养基中水苏糖最适添加量的分析

根据1.2.5 节试验方法进行复筛菌株干酪乳杆菌07-211 在水苏糖益生元不同添加量增殖培养基中生长分析，结果见图3。

由图3看出：水苏糖的添加量为0.2%时，可能由于益生元的添加量少，导致水苏糖促菌体生长效果不显著（P＞0.05）；水苏糖添加量为0.4%～0.8%时，随益生元添加量递增，活菌数显著递增（P＜0.05）；水苏糖含量达到1.0%时，活菌数增加不显著（P＞0.05），其原因可能是水苏糖含量的增加导致培养基水分活度下降，活菌增长速度减慢。综合考虑益生元促生长效果和生产成本，选择在增殖培养基中水苏糖的最适添加量为0.8%。

2.5 复筛益生菌纯种发酵水苏糖合生元酸奶工艺条件优化

图2 干酪乳杆菌07-211 的生长曲线Fig.2 The growth curve of Lactobacillus casei 07-211

图3 干酪乳杆菌07-211 在不同水苏糖添加量增殖培养基中的生长情况Fig.3 The growth situation of Lactobacillus casei 07-211 cultured in the proliferation medium with different amounts of stachyose

2.5.1 正交试验 根据1.2.7 节试验方法进行复筛益生菌干酪乳杆菌07-211 纯种发酵水苏糖合生元酸奶工艺条件优化的正交试验，结果见表3。

表3 正交试验结果Table 3 Orthogonal test results

（续表3）

由表3显示，3 个因素对干酪乳杆菌07-211纯种发酵水苏糖合生元酸奶感官评分指标的影响顺序为：蔗糖添加量（B）＞接菌量（A）=发酵温度（C），通过对感官评分极差分析得到的各因素最佳水平分别为：接种量3%（A2）、蔗糖添加量4%（B2）、发酵温度为42 ℃（C3）；3 个因素对产品活菌数指标的影响顺序为：发酵温度（C）＞接菌量（A）＞蔗糖添加量（B），通过对活菌数极差分析得到的各因素最佳水平分别为接种量3%（A2）、蔗糖添加量4%（B2）、发酵温度为39 ℃或42 ℃（C2或C3）。综合正交试验3 因素对感官品评和活菌数的影响，确定干酪乳杆菌07-211 纯种发酵水苏糖合生元酸奶工艺条件的最佳因素水平分别为：接种量3%（A2）、蔗糖添加量4%（B2）、发酵温度42 ℃（C3）。

2.5.2 验证试验 对复筛益生菌干酪乳杆菌07-211 纯种发酵水苏糖合生元酸奶工艺条件正交试验结果进行验证试验，结果见表4。

表4 验证试验结果Table 4 The results of confirmatory test

由表4可见：干酪乳杆菌07-211 纯种发酵水苏糖合生元酸奶的凝乳时间为4.15 h，pH 值为4.65，滴定酸度为71.27 °T，活菌数为3.96×109CFU/mL，感官品评得分为8.78 分，色泽均匀一致，呈乳白色，凝乳良好，组织细腻、均匀，无乳清析出和分层现象，有奶香味和发酵香气，酸甜适口。

2.5.3 复筛益生菌干酪乳杆菌07-211 纯种发酵水苏糖合生元酸奶的质量检测 根据1.2.8 节试验方法进行复筛益生菌干酪乳杆菌07-211 纯种发酵水苏糖合生元酸奶的质量检测，结果见表5。

由表5可得，复筛益生菌干酪乳杆菌07-211纯种发酵水苏糖合生元酸奶在0 d 和4 ℃贮藏21 d 时的质量均能达到发酵乳的国标；干酪乳杆菌07-211 的活菌数还极显著高于国标（P＜0.01），含有0.43 g/100 g 的水苏糖起到了促进干酪乳杆菌07-211 生长的益生元作用。

3 讨论

水苏糖不仅可以作为可溶性膳食纤维改善胃肠道功能，而且还是一种兼具低用量、低甜度、高效能、高稳定性、多功效等多种优点于一身的优良益生元。将水苏糖与能够利用其显著增殖的特定益生菌结合起来开发功能性合生元必将发挥出巨大的保健功效。关于益生元对益生菌的促生长作用具有菌种特异性的研究目前较少；而关于新型益生菌纯种发酵水苏糖合生元酸奶产品的研发尚未见报道。因此，积极筛选具有自主知识产权的适宜发酵水苏糖益生元的特定益生菌与研发具有自主创新的新型益生菌纯种发酵水苏糖合生元功能性乳制品乃大势所趋，势在必行。

表5 合生元酸奶质量检测结果Table 5 The results of quality detection of synbiotic yoghurt

目前，关于水苏糖促进益生菌生长的研究已有相关报道：舒国伟等[18]研究得出0.8%及1.0%的水苏糖添加量对两歧双歧杆菌有很好的促生长作用；魏艳等[1]的研究结果是水苏糖质量分数为0.6%时，对植物乳杆菌的增殖效果最佳；王利红等[19]、王庭欣等[20]也分别报道了水苏糖的添加量为0.7%～0.8%或者0.8%时，对保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌和双歧杆菌的各混菌组合增菌最多。但尚未见有关水苏糖对干酪乳杆菌促生长的研究报道。本研究结果得出水苏糖对干酪乳杆菌07-211 增殖的最佳添加量为0.8%，活菌数由3.19×108CFU/mL 增至2.05×109CFU/mL，增菌6.43 倍。

本课题组在此之前进行了干酪乳杆菌07-211 的功能性和安全性研究，显示干酪乳杆菌07-211 具有较强胃肠道耐受性，能够在肠道内定殖，具有抗氧化、降胆固醇及调节肠道菌群能力；无质粒，不携带可以转移的抗生素基因，对常见抗生素没有耐药性，不产生生物胺等有害代谢产物，无溶血现象，不引起急性毒性，无细菌易位现象。因此，干酪乳杆菌07-211 可以作为发酵乳制品的益生菌菌株使用。

目前，有关水苏糖-益生菌-传统发酵酸奶菌混种发酵合生元乳制品的研究已见报道：季丽媛[21]研究了添加水苏糖的功能性酸羊乳发酵工艺，酸羊乳中总菌数和益生菌数均在108CFU/mL 左右；于静等[22]研究了含水苏糖的植物乳杆菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌混菌发酵酸奶工艺，发酵的酸奶活菌数达3.95×108CFU/mL。迄今尚未见到有关新型益生菌纯种发酵水苏糖合生元酸奶的研究报道。由于益生菌与传统发酵酸奶菌在混种发酵酸奶过程中，酸奶菌抑制益生菌的生长，因此益生菌的功能大打折扣。本研究通过层层筛选，获得并运用干酪乳杆菌07-211 纯种发酵水苏糖合生元酸奶，最终活菌数高达3.96×109CFU/mL。

干酪乳杆菌07-211 纯种发酵水苏糖合生元酸奶21 d 储藏期内各项指标优于相关标准，因此，该项研究为进一步开发干酪乳杆菌07-211 纯种发酵水苏糖合生元酸奶商业化产品以及制定相关合生元酸奶标准提供了数据支撑。

综上所述，本研究筛选出能利用水苏糖进行显著增殖的新型益生菌干酪乳杆菌07-211，研制出干酪乳杆菌07-211 纯种发酵活菌含量高、保健功能强、感官风味和组织状态俱佳的水苏糖合生元酸奶，解决了新型益生菌纯种发酵水苏糖合生元乳制品的关键技术难题，为进一步工业化生产新型益生菌纯种发酵水苏糖合生元酸奶产品提供了理论依据与技术参考，也为其它功能性合生元乳制品研发提供了思路和方法。