有机阳离子转运体与水苏碱的相互作用研究＊

陈婷

（杭州医学院药学院，浙江 杭州 310053）

有机阳离子转运体与水苏碱的相互作用研究＊

陈婷

（杭州医学院药学院，浙江 杭州 310053）

目的是，研究考察水苏碱与转运体OCTs的相互作用。方法是，水苏碱为一种季铵N+化合物，在生理pH7.4的环境中一般以阳离子形式存在。小分子的有机阳离子和中性化合物可被位于肾脏、肝脏细胞基底膜上的有机阳离子转运体（OCT1、OCT2和OCT3）转运。基于水苏碱的化学结构和OCTs的肝肾分布，应用稳定高表达人有机阳离子转运体OCTs和空载体（mock）细胞（MDCK-hOCT1、MDCK-hOCT2、MDCK-hOCT3和MDCK-mock）模型，采用细胞积聚的方法来研究考察水苏碱与转运体OCTs之间的相互作用。结果是，阐明水苏碱能在一定程度上抑制OCTs的经典底物，但是，水苏碱在3种高表达人有机阳离子转运体细胞上的积聚与空载mock细胞上的积聚没有差异。由此证明，其不是这些有机阳离子转运体的底物。结论是，水苏碱与转运体OCTs之间存在一定的相互作用。

有机阳离子转运体；水苏碱；药理作用机制；药物治疗

水苏碱（stachydrine），别名为脯氨酸甜菜碱（proline betaine），是最简单的吡咯生物碱，存在于多种植物中，比如益母草。现代研究证明，水苏碱具有兴奋子宫、改善血液流变学、抗血栓等药理作用，具有潜在的开发价值和应用前景[1]。目前，国内外有关水苏碱的研究主要集中在水苏碱的分布、制备、测定和药理作用这几个方面[2-4]。

有机阳离子转运体[3]（organic cation transporters，OCTs）有多种亚型，其中以OCT1、OCT2、OCT3最为常见。研究发现，这3种亚型存在于体内多个组织，其中，OCT1和OCT2在人体肾脏的肾小管近段上皮细胞膜和肝脏上最多，所以，这2个转运体主要负责肾脏、肝脏细胞摄取药物的行为。OCT3广泛分布于人体多个组织，主要包括心脏、肝脏、大脑皮质和肠道等。OCTs主要负责小分子有机阳离子和中性化合物在体内的转运，在大多数此类化合物的组织分布方面发挥了重要的作用。研究表明，这3种转运体具有相似的底物谱，并有OCTs的大量底物和抑制剂，也有文献阐明OCTs在药物治疗中发挥了重要的作用。水苏碱为含氮的季胺生物碱，在生理pH7.4的条件下以阳离子的形式存在，因此，推测肾细胞膜上表达的OCT2、肝细胞膜上的OCT1和OCT3可能影响肾脏、肝脏细胞对水苏碱的摄取。在代谢方面，由于传统中药成分复杂，有效成分难以判断，且往往采用复方制剂给药，所以，中药与其他合用药物相互作用的可能性很大。目前，研究药物代谢的文献对中药单体与其他药物相互作用的报道尚少，因此，考察中药单体对转运体的影响对于安全、合理地使用中药有非常重要的意义。为了深入了解OCT1、OCT2和 OCT3在肝、肾细胞中处置水苏碱的作用，并推测转运体对其体内药理作用的影响，本研究考察水苏碱与转运体OCTs的相互作用，进而研究由转运体OCTs介导的水苏碱跨膜转运的特征，从而进一步了解其药理作用机制，为水苏碱的进一步开发和应用提供参考。

1 材料与仪器

1.1 材料

研究中使用的材料有：制冰机（AF100，Scotsman公司），二氧化碳培养箱（Forma Series II WaterJacketed，美国Thermo Electron公司），pH计（TOLEDO 320，瑞士METTLER公司），倒置显微镜（Olympus公司），超净工作台（Heraeus公司），气浴恒温振荡器（THZ-82，江苏金坛市金城国胜实验仪器厂），ALl04型电子天平（瑞士Mettler Toledo公司），台式高速冷冻离心机（Centrifuge 5415，Eppendorf公司），Spectramax M2酶标仪（美国Molecular Devices公司）。

1.2 试剂与药品

研究中使用的试剂和药瓶有：水苏碱（纯度＞98.0%），购自中国药检所；MPP+、西咪替丁、奎尼丁和氯雷他定购自美国Sigma公司；DMEM培养基、胎牛血清、胰酶购自美国GIBICO公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术研究所；水为18 MΩ超纯水；乙腈为色谱纯，购自美国默克公司；其他试剂均为分析纯。

水苏碱单体溶于DMSO，配成一定浓度储备液。氯雷他定内标溶液配制方法是，精密称取氯雷他定粉末100.0 mg，置于10.0 mL的DMSO中溶解，取适量储备液用乙腈稀释至内标溶液的质量浓度为100 ng/mL。

2 方法

2.1 细胞培养

MDCK-hOCT1、MDCK-hOCT2、MDCK-hOCT3 和mock细胞由本实验室成功构建，当细胞生长至融合度达到90%时，用体积分数为0.25%胰酶将细胞消化并传代。

2.2 水苏碱对甲基苯吡啶（MPP+）摄取MDCK-hOCTs细胞的作用

将MDCK-hOCT1、MDCK-hOCT2、MDCK-hOCT3细胞按密度1×105/孔接种于24孔板，生长3 d后，进行水苏碱对MPP+在细胞上积聚的实验。将细胞培养液弃除，用37℃的HBSS清洗24孔板2遍，再在37℃温度下预孵育10 min后，弃去孵育液；对照组加入1 μmol/L MPP+的HBSS（pH7.4）200 μL，水苏碱物质的量浓度为 0.001～100 μmol/L。37 ℃孵育后迅速将孵育液弃去，用冰浴中的PBS洗3遍24孔板来终止细胞积聚反应，再用质量分数为0.1%的SDS裂解孔内细胞，反复吹打细胞，收集裂解液，放离心管中。在裂解液中加入乙腈溶液（含内标氯雷他定）沉淀蛋白，漩涡震荡、离心，取上清液分析检测MPP+。另取SDS细胞裂解液，采用商品化BCA试剂盒测定每孔细胞的总蛋白量。每个样品的细胞摄取结果用每孔蛋白总量来校正[1-2]。

2.3 OCTs抑制剂对水苏碱细胞摄取的作用

将MDCK-hOCT1、MDCK-hOCT2、MDCK-hOCT3细胞按密度1×105/孔接种于24孔板，生长3 d后，进行OCT1、OCT2、OCT3抑制剂对水苏碱在细胞摄取的抑制实验。弃去细胞培养液，用37℃的HBSS洗2遍板，37℃预孵育后将孵育液弃去。对照组加入水苏碱，物质的量浓度为1 μmol/L，抑制组加入相同浓度水苏碱和阳性抑制剂100 μmol/L（OCT1：奎尼丁；OCT2：西咪替丁；OCT3：奎尼丁）。37℃孵育设定的时间后，迅速将孵育液弃去，用冰浴中的PBS洗3遍来终止细胞积聚反应，0.1%的SDS裂解后，以下步骤同“2.2”所述操作步骤。

3 结果

结果表明，水苏碱对MPP+在MDCK-hOCTs细胞上摄取的抑制有一定的作用，如图1所示：OCT1、OCT2、OCT3的IC50值分别为30.52µmol/L、35.35µmol/L、42.25µmol/L。进一步对水苏碱在3种细胞及mock细胞中的积聚进行研究，发现在这3种细胞的积聚无显著差异，而水苏碱在细胞中的积聚高于mock细胞。为了进一步验证水苏碱是否为hOCTs的底物，我们考察了OCTs的经典抑制剂对水苏碱在hOCTs细胞上摄取的抑制情况。结果显示，如图2所示，水苏碱不可以被OCTs的抑制剂奎尼丁、西咪替丁抑制，提示水苏碱不是hOCTs的底物。

图2 OCTs的抑制剂西咪替丁、维拉帕米对水苏碱在hOCTs细胞上摄取的抑制作用

4 讨论

目前，国内外有关水苏碱的研究主要集中在水苏碱的分布、制备、测定和药理作用这几个方面。

4.1 水苏碱的分布方面[3]

水苏碱主要存在于白花菜科（Capparidaceae）、唇形科（Labiatae）、芸香科（Rutaceae）、豆科（Leguminosae）和菊科（Compositae）植物中。外国研究人员在卫矛科植物的提取物中也发现了水苏碱，不仅不同植物中水苏碱的含量相差比较大，而且同种植物中水苏碱的含量也有很大差异。出现这种情况的主要原因是，同种植物生长在不同地区，植物生长的环境不同（比如气候、土壤、植被）。例如，研究中发现，益母草全草的提取物中水苏碱含量差异较大，少者产于酸性土壤的南方地区，水苏碱含量只有大约0.59%；而多者产于碱性土壤的北方地区，水苏碱含量高达1.72%.另外，同一株益母草中不同部位水苏碱的含量也有差异，其中，繁殖部位的水苏碱含量最高，第二位是叶，茎中含量最低。通过研究熟悉益母草中水苏碱的含量，它是随益母草部位、生长时期和产地等条件的不同而不同，这对于确定益母草的最佳采收地和采收期有很大帮助。

4.2 水苏碱的制备方面

目前，提取水苏碱时主要有操作简单的超声提取法、先进的索氏提取法和最经典的加热回流法，其中，以超声提取法操作工艺最为简单[4]，既不需要加热，也不需要回流，提取效率也比较高，因此，应用频繁。

4.3 水苏碱的测定方面

近年来，对于水苏碱含量的测定，多采用高效液相与其他技术联用的方法，比如张彦飞等人[5]用高效液相色谱—蒸发光散射检测器法测定中药茺蔚子中盐酸水苏碱的含量。

4.4 水苏碱的药理作用方面

刘红燕等人[6]研究发现，水苏碱能够减轻过氧化氢所致肾小管上皮细胞损伤。国外又有报道称，水苏碱能改善血液流变学，降低血液黏稠度[7]。

综上所述，研究人员在水苏碱的以上几个方面做了大量工作，鉴于水苏碱医药方面的应用价值，所以，仍需进一步研究水苏碱的药动学、药效学机理，特别是水苏碱在体内过程的发展变化，这些对于其开发和应用有非常重要的意义。

［1］Urakami Y，Okuda M，Masuda S，et al.Functional characteristics and membrane localization of rat multispecific organic cation transporters，OCT1 and OCT2，mediating tubular secretion of cationic drugs［J］.J Pharmacol Exp Ther，1998，287（2）：800-805.

［2］Sato T，Masuda S，Yonezawa A，et al.Transcellular transport of organic cations in double-transfected MDCK cells expressing human organic cation transporters hOCT1/hMATE1 and hOCT2/hMATE1［J］.Biochem Pharmacol， 2008（76）：894-903.

［3］李林.水苏碱的研究概况［J］.安微农业科学，2009，37（3）：931.

［4］任江剑，徐建中，王志安.HPLC法测定鲜益母草中盐酸水苏碱含量［J］.中药新药与临床药理，2006，17（3）：216-218.

［5］张彦飞，李智萌，蔡广知，等.高效液相色谱-蒸发光散射检测器法测定中药茺蔚子中盐酸水苏碱的含量［J］.中国医药导报，2015，12（15）：124-127.

［6］刘红燕，王瑞，石明，等.小剂量盐酸水苏碱对过氧化氢所致肾小管上皮细胞凋亡的保护作用［J］.中国中西医结合肾病杂志，2008，9（9）：760-763.

［7］李晓楠，陈佳音，孙晓琳，等.有机阳离子转运体的研究进展［J］.中国临床药理学与治疗学，2013，18（8）：954-960.

〔编辑：白洁〕

R969.1

A

10.15913/j.cnki.kjycx.2017.23.001

2095－6835（2017）23－0001－03

2015年度高校国内访问学者专业发展项目“有机阳离子转运体与水苏碱相互作用研究”（编号：123）