几种阳离子和葡萄糖对子一代达氏鲟精子活力的影响

龚进玲　柴毅　罗静波

关键词：达氏鲟；子一代；精子活力；阳离子；葡萄糖

中图分类号：S965.215 文献标志码：A 文章编号：1002—1302（2016）01—0257—03

达氏鲟（Acipenser dabryanus Dumeril）隶属鲟形目、鲟科、鲟属，为我国较大型淡水经济鱼类，现主要分布于金沙江下段和长江上游干流。由于过度捕捞、水体污染以及水利工程建设等诸多因素，导致生态环境遭到严重破坏，野生种群资源不断下降，达氏鲟的分布区逐渐缩小。于1996年被国际自然保护联盟（IUCN）列入红皮书中，并被评为国家一级野生保护动物。2007年成功获得子二代达氏鲟鱼苗之后，达氏鲟规模化全人工繁殖也取得重大突破。目前达氏鲟的报道较少且不系统，主要包括消化系统、池塘养殖、分子进化、形态结构等方面。

鱼类精子活力与水环境（盐度、温度、pH值、渗透压、离子）、亲鱼激素水平及繁殖季节等因素有关，这也是鱼类精子生理特性与环境相适应的结果。在鱼类繁育中，精子活力能反映精液质量并预测受精率，因此研究精子生物学是非常必要的，并且可为精子冷冻保存提供理论依据，进一步优化冷冻程序。本试验通过对子一代达氏鲟精子生物学的研究，探讨精子与阳离子及葡萄糖之间的关系，可对现行达氏鲟淡水人工养殖技术有积极指导作用，还可为提高全人工繁殖的受精率以及以后该鱼的精子稀释液和保存液的配制提供科学理论依据。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1人工蓄养子一代达氏鲟亲本 达氏鲟亲本是由四川宜宾珍稀水生动物研究所经野生中华鲟人工繁殖所获得的子一代个体。2006年运输至中国水产科学院长江水产研究所中华鲟繁育基地培育，于2013年4月11—16日实施人工繁育，共催产2尾雄鱼和2尾雌鱼。

1.1.2精子获得 利用B超对达氏鲟性腺发育进行监测，并筛选成熟亲鲟开展人工繁殖催产。采用一针注射法对子一代达氏鲟催产，注射LHRH-A₂催产剂12 h后分6批次采集精液，合计采精量300 mL。所获得的精液装入干燥洁净的双层塑料保鲜袋中，充入纯氧气后放入4℃冰箱中冷藏保存，每4 h換气1次。

1.1.3试验溶液的配制 各试验溶液浓度梯度设置见表1。

1.2试验方法

精子的活力测定方法参照严安生等的分级标准。本次试验测量快速运动时间和寿命，即激液与启动液混合开始，视野中70%以上的精子转入慢速运动为止，为快速运动时间（fast movement time，以下简称FT）。精子激活开始到95%以上的精子停止颤动所经历的时间，为寿命时间（life time，以下简称LF）。每个浓度的溶液中同一样本精子活动情况的观测重复3次，最后结果取平均值。

1.3统计分析

试验数据用SAS V8.02统计软件进行统计分析。

2结果与分析

2.1 NaCl溶液对子一代达氏鲟精子活力的影响

NaCl溶液对子一代达氏鲟精子活力的影响见图1。随着NaCl溶液浓度升高，LT不断上升。在NaCl浓度为0.25%时LT最长，为219.67 s。而后随着浓度升高急速下降。精子FT呈上升趋势，其峰值（66.67 s）出现在浓度为0.20%时，当浓度大于0.20%后FT逐渐下降。

方差分析结果表明，NaCl浓度为0.20%时的FT与其他浓度之间差异显著（P<0.05）。NaCl浓度为0.25%时LT与其他浓度之间差异显著（P<0.05）。

2.2 KCl溶液对子一代达氏鲟精子活力的影响

不同浓度KCl溶液对子一代达氏鲟精子活力的影响见图2。子一代达氏鲟精子对K⁺含量变化非常敏感。LT与FT变化规律相似，随着KCl溶液浓度升高，LT和FT呈逐渐上升的状态，在其浓度为0.000 4%时，LT、FT分别达到124.67、52.67 s。当KCl溶液浓度超过0.000 4%后子一代达氏鲟精子LT和FT急速下降。

方差分析结果表明，KCl浓度为0.000 4%时的FT、LT与其他各浓度组之间差异显著（P<0.05）。0.010 0%、0.001 2%、0.001 4%、0.001 6%KCl溶液浓度组所对应的LT之间无显著性差异（P>0.05）。

2.3 CaCl₂溶液对子一代达氏鲟精子活力的影响

不同浓度CaCl₂溶液对子一代达氏鲟精子活力的影响见图3。随着CaCl2浓度逐渐增加，LT和FT呈上升趋势，至浓度为0.10%时均达到最高值，分别为113.67、28.67 s。当CaCl₂溶液浓度达到0.30%时，精子活力明显受到抑制，大多数只是微微颤动，极少数缓慢游动。

方差分析结果表明，CaCl₂浓度为0.30%、0.40%和0.45%时，所对应的FT无显著性差异（P<0.05），0.10%CaCl₂浓度组所对应的Fr、TJT与其他各浓度组之间存在显著性差异（P<0.05）。

2.4 MgCl₂溶液对子一代达氏鲟精子活力的影响

不同浓度MgCl2溶液对子一代达氏鲟精子活力的影响见图4。随着MgCl2浓度不断上升，精子LT、FT开始不断上升。浓度为0.30%时精子LT最长，为102 s；FT也最长，为25 s。而后随着MgCl₂溶液浓度的上升呈明显下降趋势。

方差分析结果表明，MaCl₂浓度为0.30%时FT与其他浓度组之间差异显著（P<0.05）。0.25%和0.40%MgCl2浓度组所对应的LT无显著性差异（P>0.05），浓度为0.30%时所对应的LT与其他各浓度组之间存在显著性差异（P<0.05）。

2.5葡萄糖溶液对子一代达氏鲟精子活力的影响

由图5可知，子一代达氏鲟精子在不同浓度葡萄糖溶液中活力存在明显差异。随着葡萄糖溶液浓度逐渐增加，TJT和FT呈缓慢趋势延长，在浓度为0.60%时活力明显增加，当葡萄糖浓度达到0.70%时LT、FT最长，分别为259、74.67 s。而后随着浓度升高其活力呈下降趋势。

方差分析结果表明，0.70%葡萄糖浓度组所对应的FT与其他各组之间存在显著性差异（P<0.05）。0.20%、0.60%、0.70%葡萄糖浓度组所对应的LT之间无显著性差异（P>0.05），其中，0.70%浓度组所对应的LT达到峰值。

3讨论

3.1 NaCl、KCl溶液对精子活力的影响

鱼类精子在精巢和等渗溶液中是不运动的，但是却存在着极强的潜在活动能力。排出体外的精子一旦与水或非等渗溶液相结合便会激烈运动，即激活。精浆与外部介质具有差异性，体现在离子组成成分和渗透压上。鱼类精子的抑制与激活机制与种类有关，其活力与精子对离子和渗透压的敏感程度有关。Morisawa等表明鲑科（Salmonidae）鱼类精浆中高出血浆数倍的K⁺是抑制精子运动的因素，而精浆中K⁺含量是血浆的18～29倍的鲤科（Cyprinidae）鱼类，其K⁺含量不阻止精子运动，反而能提高精子运动速度。鲟鱼类精子的敏感性由精浆的成分和Na⁺含量决定。离子对不同鱼类精子的影响效果具有很大差异，研究理化因子对子一代达氏鲟精子活力的影響对现行人工繁殖技术的指导十分必要。

Na⁺是鱼类精浆重要组成成分和构成渗透压的主要离子。胭脂鱼（Myxocyprinus asiaticus）精子在0.60%NaCl浓度时快速运动时间最长；0.30%NaCl能延长翘嘴红鲌（Erythroculter ilishaefor）精子快速运动时间；刘鉴毅等发现中华鲟（Acipenser sinensis Gray）精子在0.10%NaCl溶液中快速运动最长。本试验中测得子一代达氏鲟精子在NaCl溶液浓度为0.25%时寿命时间最长，在0.20%时陕速运动时间最强，两者变化规律相似。

鲟鱼类精子对K⁺浓度的变化最为敏感。从西伯利亚鲟（Acipenser baerii Brandt）、湖鲟（Acipenser fulvescens）和中华鲟精子在K⁺浓度变化中发现鲟鱼类精子对低浓度K⁺的敏感性极强，但活力可受低浓度K⁺调控。Alavi等研究表明K⁺是抑制鲟鱼类精子在精浆中活动的主要因子。本试验发现当K⁺浓度大于0.000 4%时精子寿命时间和快速运动时间逐渐缩短，说明高浓度的K⁺对精子有明显的抑制作用，而K⁺含量只有低于精浆浓度时才能增强精子活力，延长寿命时间。

NaCl、KCl对精子活力的影响都表现在渗透压方面。当精子在水中活动时，内外渗透压的差距促使精子调节平衡，从而消耗大量的自身能量。若将精子处于等渗溶液中，必然会使存活时间明显延长，原因在于调节渗透压时所用的能量转用于维持其生命活动。因此，在人工繁殖过程中配制与亲本渗透压相当的稀释液，对提高精子受精率、增加渔业产量有重要意义。

3.3葡萄糖对精子活力的影响

葡萄糖、半乳糖、果糖是精浆的重要成分碳水化合物中主要成分。Gardiner认为体外授精的鱼类精子可利用细胞外源性营养物质为精子运动提供能量。已有研究表明，适宜的葡萄糖浓度可明显延长白斑狗鱼（Esox lucius）、高白鲑（Coregouns peled）及中华鲟精子的活动时间。在本次试验中，可以看出葡萄糖在适宜浓度时有延长子一代达氏鲟精子寿命的作用，这与上述研究观点一致。表明子一代达氏鲟精子可以利用外源性葡萄糖补充在整个运动活动中所消耗的能量，从而提高精子寿命时间。

3.4本研究的局限性

精子活力能较准确地预测受精率，而精子受精率的大小直接影响人工繁殖效果，但会受到水环境的影响。本试验对子一代达氏鲟精子在几种离子和葡萄糖下活力影响进行初步试验，未对其授精效果进行研究，其合适的人工授精激活液浓度未知，可在以后的研究中进行探讨。