丙戊酸钠干预对癫痫鼠模型海马区B1及B2受体表达的影响

刘 方 张 敏 刘恒方 刘田田 郭世燕

1)郑州大学第五附属医院，河南 郑州 450052 2)郑州大学第一附属医院，河南 郑州 450052 3)郑州新郑国际机场急救中心，河南 郑州 451161

研究发现[1-2]B1与B2激肽受体(kinin B1 and B2 receptors；KB1R，KB2R)与癫痫的发作次数及发作持续时间密切相关，KB1R激动剂促进肌糖磷酸化一系列病理变化，诱发细胞内Ca2+水平升高，继而导致癫痫的发作[3-5]；此外，KB1R及KB2R可上调磷脂酶A2表达，使前列腺素增加，从而诱导组织水肿，这些机制与癫痫发作后的脑组织水肿有关。已有学者[6-7]通过放射配基结合技术探讨KB1R及KB2R不同程度阻断后对动物模型癫痫发作的影响[8-10]，揭示KB1R及KB2R在癫痫发作过程中的作用机制。本研究应用丙戊酸钠干预癫痫鼠模型，观察不同时间内海马区KB1R及KB2R的表达变化，探讨其作用机制，试图寻找癫痫发作新的作用机制与治疗靶点。

1 资料与方法

1．1实验动物及分组选取郑州大学动物中心提供的35只健康雄性Wistar成年大鼠，体质量(250±15.45)g，月龄3～4个月，按照随机化原则分为癫痫实验模型组30只，采用氯化锂-匹罗卡品点燃法制作癫痫模型，再分为癫痫模型干预组15只，其中癫痫持续状态后急性期组5只(12 h，Ⅰ组)，静止期组5只(5 d，Ⅱ组)，慢性期组5只(60 d，Ⅲ组)；癫痫模型无干预组共15只，也分为3个小组，急性期无干预组5只(12 h，Ⅰa组)，静止期无干预组5只(5 d，Ⅱa组)，慢性期无干预组5只(60 d，Ⅲa组；同时设置空白对照组5只(Ⅳ组)。

1．2氯化锂-匹罗卡品癫痫模型建立及给药方法Wistar鼠给予氯化锂125 mg/kg腹腔注射，18～20 h后给予匹罗卡品10 mg/(kg·次)腹腔注射。观察鼠模型达5级后经鼻饲法灌入丙戊酸钠，每4 h灌胃1次，1 mg/(kg·次)。按照相应时间点处死动物，取海马标本置入液氮中保存。

1．3RT-PCR法取约50 mg海马组织，按相关文献法提取总RNA。采用一步反应法完成RT-PCR反应，其引物及产物片断见表1。

表1 B1、B2受体及内参照β-acting基因引物

1．4Westernblot法检测KB1R及KB2R蛋白表达采用美国Eagle EyeII型凝胶图像系统分析目标蛋白和标准对照的光密度，取两者比值作为目标蛋白半定量相对值。

2 结果

2．1氯化锂-匹罗卡品癫痫模型的观察大鼠注射匹罗卡品后，可以观察到Racine制定的痫性持续发作形式。

2．2KB1RmRNA及KB2RmRNA表达变化给予丙戊酸钠干预模型后，与Ⅰa组比较，Ⅰ组KB1R mRNA表达均显著下调(P<0.05)，Ⅰ组KB2R mRNA表达均显著上调(P<0.05)；与Ⅱa组比较，Ⅱ组KB1R mRNA表达显著下调(P<0.05)；与Ⅲa组比较，Ⅲ组KB2R mRNA表达均显著上调(P<0.05)；与空白对照组比较，Ⅰa组及Ⅱa组KB1R及KB2R表达均显著上调(P<0.05)，Ⅲa组KB2R表达均显著上调(P<0.05)。见表2。

表2 各组B1、B2 激肽受体的mRNA表达水平比较光密度值OD)

2．3KB1R及KB2R的蛋白质表达变化给予丙戊酸钠干预模型后，与Ⅰa组比较，Ⅰ组KB1R蛋白质表达均显著下调(P<0.05)，Ⅰ组KB2R蛋白质表达均显著上调(P<0.05)；与Ⅱa组比较，Ⅱ组KB1R蛋白质表达显著下调(P<0.05)；与Ⅲa组比较，Ⅲ组KB2R蛋白质表达均显著上调(P<0.05)；与空白对照组比较，Ⅰa组及Ⅱa组KB1R及KB2R表达均显著上调(P<0.05)，Ⅲa组KB2R表达均显著上调(P<0.05)。见表3。

表3 药物干预后模型B1、B2 激肽受体蛋白质表达水平比较光密度值OD)

3 讨论

分子生物学技术研究表明[12-13]KB1R激活后可导致肌糖磷酸化，升高细胞内Ca2+水平；KB1R及KB2R激活后可诱导组织水肿，产生前列腺素[14]，细胞分裂素(丝裂原)活化蛋白激酶可通过KB1R及KB2R激活，从而导致早期即刻基因的表达和AP-1易位[15-16]。HOPP等[17]报道的KB1R的激活加剧了兴奋性细胞毒作用和海马神经元的凋亡。研究发现癫痫发作诱导了Wistar鼠海马的KB1R mRNA重新合成，证实同期组的KB1R表达上调[18-20]。ARGANARAZ等[21-24]用KB1R及KB2R基因敲除小鼠癫痫模型，发现KB1R基因敲除小鼠自发癫痫次数减少，海马区细胞脱失减少，苔藓纤维增生不明显；KB1R基因敲除小鼠自发癫痫次数增加，海马区细胞脱失明显增加，苔藓纤维增生显著，提示KB1R可能加重颞叶癫痫的病损程度，而KB2R则可能对颞叶癫痫发作后的海马组织有保护作用[25-27]。

本实验中氯化锂-匹罗卡品点燃鼠癫痫模型的KB1R及KB2R mRNA及蛋白质表达水平有较大差异，KB1R在癫痫模型早期表达上调较明显，此后逐渐下降，而且KB1R及KB2R mRNA及蛋白质表达水平基本一致，与国外研究结果不完全相符，可能由于本实验方法较为灵敏的缘故[28-30]。丙戊酸钠与苯妥英钠有相同的抑制Na+通道的电生理作用现象，丙戊酸钠真正的抗痫作用机制尚不十分清楚[31]。丙戊酸钠干预癫痫模型鼠后大鼠海马组织早期KB1R表达明显减少，晚期KB2R表达明显增加，支持丙戊酸钠与颞叶癫痫的KB1R及KB2R表达变化相。丙戊酸钠可抑制癫痫早期B1激肽受体的高表达，增加晚期B2激肽受体的表达，本研究也证实KB1R及KB2R参与了癫痫的发生与维持机制，通过丙戊酸钠干预进一步表明海马区KB1R表达下调，支持KB1R可能具有细胞毒作用，KB2R可能有脑细胞保护作用。因此，通过调节海马区KB1R及KB2R表达水平亦可能成为抗癫痫新的潜在靶点。