中性粒细胞胞外诱捕网与缺血-再灌注损伤关系的研究进展

王华卿 张浩 沈东海 魏炳玉 王梓卉 许瑾瑾 钟晓鸣

475000 开封，河南大学淮河医院心内科

中性粒细胞是人体含量最多的天然免疫细胞，起到重要的免疫防御作用。通常认为中性粒细胞通过吞噬、释放抗菌肽抵抗微生物入侵，近年来，研究者发现了一种新机制—中性粒细胞外诱捕网(neutrophils extracellular traps，NETs)[1]。2004年，有研究者初次发现NETs的存在，在体外用白细胞介素8(interleukin，IL-8)、佛波酯(phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA)或脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激中性粒细胞后，发现细胞表面形成明显突起，一段时间后在电镜下观察发现细胞周围存在一种网状结构[2]。NETs是中性粒细胞在活性氧(reactive oxygen species，ROS)、肽酰基精氨酸脱亚氨酶4(peptidylarginine deiminase 4，PAD4)、自噬等多种因素[3]的影响下释放出的一种以DNA为基本骨架，附着以颗粒蛋白和组蛋白的高浓度丝网状结构。NETs的释放过程称为NETosis，这是一种区别于细胞坏死与细胞凋亡的过程，目前并不清楚NETosis的具体机制是什么，但通常认为与细胞膜的破裂或囊泡的释放有关[4]。

1 NETs产生、释放及与凋亡、坏死的区别

高分辨率扫描电子显微镜显示，NETs由DNA片段和蛋白质组成。经过染色后发现DNA是NETs的主要结构成分，在使用脱氧核糖核酸酶(DNase Ⅰ)短暂处理后造成了NETs的崩解。相反，蛋白酶处理后NETs骨架较为完整，这表示DNA不受影响[2]。通过免疫荧光分析证实，NETs含有中性粒细胞弹性蛋白酶、组织蛋白酶G、髓过氧化物酶、乳铁蛋白和明胶酶等蛋白质，但NETs中不存在常见的胞质蛋白[2]。

NETosis包括细胞的去核化，染色质的去浓缩、核膜以及颗粒膜的崩解[1]，并不一定造成细胞死亡[5-6]。NETosis可以由微生物和内源性刺激引发，例如损伤相关模式分子和免疫复合物、胆固醇晶体、细菌、真菌、病毒等[7]。NETosis不同于细胞凋亡和细胞坏死：发生NETosis时核膜分解后核内容物与颗粒蛋白合并、染色质去浓缩，细胞收缩将DNA和蛋白质排出形成NETs，NETs在细胞外固定病原微生物，使其成为免疫细胞的靶点；细胞凋亡是程序化死亡，细胞收缩、染色质凝聚、细胞核分段化、细胞质出现空泡；坏死源于急性细胞损伤，细胞膨胀，失去分叶核核型直到细胞膜破裂并释放内容物到胞外。与凋亡不同的是，NETosis和坏死都导致组织炎症的发生[1]。

NETs的释放方式有两种(图1)，第一种是由金黄色葡萄球菌通过补体受体或Toll样受体2(toll-like receptor 2，TLR2)，或通过大肠杆菌作用于TLR4或TLR4激活的血小板诱导。在几分钟内发生NETosis，可独立于细胞死亡而发生，包括核膜破裂排出染色质，释放颗粒蛋白。释放NETs后留下活化的无核细胞质，继续发挥吞噬作用；第二种是PMA、抗体、胆固醇晶体诱发的NETosis，在刺激数小时后细胞膜破裂排出NETs，中性粒细胞死亡[7]。

图1 NETs的两种释放方式

我们还发现，不同的研究者对NETs的释放过程以及释放出NETs后细胞死亡的定义有所不同，在相应定义下涉及的细胞类型也有所区别。例如有研究者将NETs释放后的死亡方式称为NETotic细胞死亡[8]，但这种方式仍缺乏较为明确的表型[9]，本文仍使用NETosis对中性粒细胞胞外诱捕网的释放过程进行称谓，认为NETs释放后的细胞死亡是NETosis发生后的一种结果。

2 调控NETs形成的关键因素

PAD4在NETs形成中也起到关键作用，其将组蛋白的精氨酸残基瓜氨酸化形成瓜氨酸化的组蛋白(CitH3)，只有染色质去浓缩才能形成NETs，而瓜氨酸化的组蛋白直接参与了这一过程。用PAD4敲除小鼠与野生型小鼠共同实验，给予相同的LPS与PMA处理后用蛋白印迹法检测发现PAD4敲除小鼠体内没有CitH3，且没有发现NETs的形成[10]。如果对PAD4敲除小鼠进行处理，使其PAD4过表达后会发现小鼠在36 h内出现高密度的CitH3、去浓缩的染色质，之后形成了大量细胞外网状结构。此过程中未发现caspase-3的剪切，这也证明了PAD4过表达后引起的不是细胞凋亡而是NETosis[11]。细胞内Ca2+峰值对于在中性粒细胞激活时细胞内信号转导是十分重要，并且PAD4由Ca2+激活[3]。

中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase，NE)与髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)也在调节NETs形成过程中起到了重要作用。中性粒细胞未受刺激时，NE和MPO储存在胞质的颗粒中。在活化和ROS产生后，NE从颗粒易位至细胞核并切割组蛋白以及促进染色质去浓缩。随后MPO与染色质结合促进染色质去浓缩。NE对于NETs形成是必不可少的，NE和MPO协同增强染色质去浓缩，导致细胞膜破裂和NETs的释放。实验还发现NE基因敲除小鼠无法形成NETs[12]。

自噬参与NETs的释放。mTOR(雷帕霉素靶蛋白)是在包括中性粒细胞在内的许多哺乳动物细胞中参与自噬的关键调节因子。抑制mTOR活化可以驱动自噬发生，诱导组蛋白瓜氨酸化与NETs的释放[13]。在使用针对自噬的抑制剂渥曼青霉素时发现细胞不再出现空泡化、染色质也无法去浓缩，导致了NETosis的减少与细胞凋亡的增加[14]。

3 NETs与I/R损伤

大量研究表明NETs加剧I/R损伤。动脉搭桥术、溶栓疗法、经皮腔内冠脉血管成形术、心脏外科体外循环、心肺脑复苏，断肢再植和器官移植等方法的建立和推广应用，使许多组织器官缺血后重新得到血液再灌注。其目的在于恢复组织器官功能并起到修复作用，但同时也导致了I/R损伤。其发生机制尚未阐明，但认为线粒体损伤、自由基生成增多、钙超载、炎症反应过度激活可能是主要原因。

3.1 心脏I/R损伤

目前，临床上主张早期进行再灌注作为急性心肌梗死的主要治疗方式之一。溶栓治疗和经皮腔内冠状动脉介入治疗都旨在降低心肌损伤的程度。然而，大量的实验和临床证据表明，再灌注可以通过阻塞的冠状动脉恢复血流，但加剧了心肌损伤程度[15]。心肌I/R存在多种病理生理学现象，包括心律失常、心肌顿抑、无复流现象、炎症等[16]。影响其发生的关键因素有氧化应激、钙超载、pH的快速恢复、线粒体膜电位的破坏等[17]。在受到I/R损伤的心肌中发现了NETs的存在[18]。心肌I/R损伤导致细胞因子增加、自噬激活和ROS的生成，对NETosis的发生十分关键。在心肌缺氧部位的血液循环中，NETs的形成不仅为血栓形成提供了支架，而且会加重内皮细胞的损伤，这两者都是造成冠状动脉无复流的重要原因。在使用rt-PA的基础上加入DNase Ⅰ处理后发现心梗面积下降，M型超声心动图显示心脏功能改善且比单一使用纤溶酶原激活剂(recombinant tissue plasminogen activator，rt-PA)或DNase Ⅰ效果显著[19]。这证明了NETs在心肌I/R中发挥了加剧损伤的作用。rt-PA和DNase Ⅰ联合治疗主要针对I/R中NETs引起的无复流现象。

3.2 脑I/R损伤

在研究缺血性中风的实验中建立了大鼠永久大脑中动脉堵塞再灌注模型(middle cerebral artery occlusion/reperfusion，MACO/R)的模型，中性粒细胞在受伤后很快渗入受损的脑组织并加重炎症，随后在不同的时间点于软脑膜、纹状体、脑实质中发现了CitH3，证明了NETs的存在。一种损伤相关模式分子(DAMP)—HMGB1，在MACO/R模型中大量积累在血清中，促进了CitH3的形成。全巯基和二硫化物类型的HMGB1分别通过其特异性受体CXCR4和TLR4诱导CitH3。重要的是，HMGB1不仅诱导了NETosis，而且作为NETs的一部分被排出细胞外，有助于NETosis介导的神经元死亡。在神经细胞死亡和NETosis之间存在恶性循环[20]。脑缺血后处理(ischemic post-conditioning，IPOC)已被证明对脑I/R损伤具有神经保护作用。IPOC可以抑制自噬与HMGB1释放。自噬[21]与HMGB1[22]均已被证实在脑I/R损伤中发挥了作用；自噬[3]与HMGB1[20]也在NETs形成中发挥了作用，因此我们考虑自噬与HMGB1可能是通过NETs的形成加剧了脑I/R损伤。

3.3 肝I/R损伤

在肝脏I/R损伤模型中，重组HMGB1蛋白处理后通过TLR4/9增加CitH3表达和NETs的形成参与了I/R损伤[20]。聚环氧乙烷(DRP)是一种用于减少血管内阻力的无毒聚合物，在小鼠肝脏缺血-再灌注损伤后发现高水平CitH3，用DRP处理后其含量下降，而且与对照相比，在DRP处理的肝脏I/R的小鼠中，MPO-DNA复合物在血清中的含量降低。DRP也会减少肝脏中血小板聚集和微血栓形成，可能是通过作用于NETs来实现的，这也证明了NETs可能通过嵌顿血管的无复流现象造成缺血-再灌注损伤。

3.4 肠I/R损伤

当大鼠发生肠I/R损伤时，大量中性粒细胞就会渗入肠道组织，然后发生NETosis导致游离DNA(cfDNA)大量释放到血液中。在缺血1 h和再灌注2 h后，大鼠血清和回肠组织中很容易检测到细胞外DNA。这与先前的诸多研究结果相吻合，认为这证明了NETs的存在。NETs可以破坏肠上皮细胞而导致炎症反应，加剧了肠道损伤，肠道I/R损伤后细胞紧密连接和细胞骨架结构的功能完整性被破坏。因此认为NETs参与了I/R损伤后的肠道炎症的发生[23]。

3.5 肾I/R损伤

PAD4在I/R诱导的急性肾损伤中起关键作用。在小鼠肾I/R之前，用DNase Ⅰ处理可以抑制NETs形成并且部分保护小鼠免受I/R诱导的肾损伤。PAD4特异性抑制剂YW3-56有效抑制I/R诱导的小鼠肾损伤。在PAD4缺陷小鼠中，来自野生型小鼠的中性粒细胞的转移足以促进肾脏中的NETs形成和I/R后肾功能的降低。相比之下，在接受来自PAD4缺陷小鼠的嗜中性粒细胞的PAD4敲除小鼠肾脏中未显示出可检测的NETs，并且受到I/R诱导的肾损伤的保护。通过该实验发现NETs的有无和肾功能的降低与否是同步的[24]。

3.6 肢体I/R损伤

TLR已被证明在介导静脉血栓形成和心脏和大脑的I/R损伤中发挥了关键作用，且TLR在NETs形成中发挥了重要作用[7]。TLR4突变小鼠后肢I/R损伤的减轻也与NETs的减少有关。通过野生型(WT)小鼠与TLR4突变(TLR4m)小鼠进行实验，将小鼠后肢进行I/R，发现WT组的肌纤维损伤显著大于TLR4m组，WT组的MPO阳性细胞显著多于TLR4m组，显现出MPO标记阳性的细胞即中性粒细胞密度增加的区域也显示NETs含量的增高。NETs主要存在于间质组织，血管周围和微血管血栓中。经免疫荧光显示在TLR4m 组中NETs的量较低，并且在对照对侧后肢组织切片中检测不到NETs的存在，而在DNase Ⅰ处理后对WT组织切片进行NETs染色后发现免疫荧光显示间质中NETs显著减少[25]。

NETs在器官I/R损伤中起到了负面的作用，表现为降低器官功能、引起炎症、与内皮细胞作用并造成损伤、导致神经细胞死亡、嵌顿微血管等。

4 结论

中性粒细胞在I/R损伤中起到关键作用，NETs由中性粒细胞释放，且NETosis与I/R损伤的机制存在交集，例如通过NADPH产生ROS、Ca2+超载与对PAD4的激活、TLR家族的TLR4在炎症反应与NETs形成中均发挥作用，因此NETs参与并影响了组织器官的I/R损伤。现在，尚不明确NETs是通过何种机制参与并影响I/R损伤，我们猜测可能是NETs作用于血管内皮细胞造成水肿以及细胞间隙增大并在损伤部位聚集造成了微血管嵌顿、损伤黏膜上皮细胞及细胞联接加剧炎症、NETs上附着的颗粒蛋白具有细胞毒性造成组织细胞损伤并延缓组织修复、刺激巨噬细胞与树突状细胞产生细胞因子造成炎症反应过度激活等，以此为研究方向可能会有所进展。通过减弱I/R损伤后的氧化应激、抑制PAD4的活性、防止Ca2+浓度剧烈变化、抑制TLR4参与的信号通路活性、减弱NETs上的颗粒蛋白毒性可能会缓解NETs造成的损伤[26-27]。将NETs作为治疗的靶点或采用针对NETs的治疗方案可以减缓I/R损伤，这对疾病治疗具有重要意义。

利益冲突：无