肠道双歧杆菌与心房颤动的相关性研究

金珊珊 黄婉露 张苗苗

150070 哈尔滨医科大学附属第一医院群力院区心内科

心房颤动(简称为“房颤”)是临床常见心律失常之一，可导致动脉栓塞和心力衰竭等严重并发症，具有较高致残率和致死率，是威胁人类健康的重大疾病[1]。流行病学研究显示，房颤发病率约为1%～2%[2]。但其发病机制尚不完全清楚，目前认为心房重构是其重要病理机制[3]。肠道菌群参与调控机体免疫系统、宿主防御和吸收代谢等生物学过程，在多种疾病发生发展中发挥重要作用[4]。大量研究证实，肠道菌群及其代谢产物参与冠心病、高血压和心力衰竭等心血管疾病的发生，故有望成为心血管疾病新的防治靶点[5]。新近研究证实，与窦性心律人群相比，房颤患者肠道菌群多样性及其代谢产物发生显著改变[6]。双歧杆菌是机体肠道最常见的有益菌。既往文献证实，双歧杆菌在维持机体稳态，预防疾病发生中具有重要作用，但双歧杆菌与房颤是否存在相关性尚不清楚[7]。本文主要通过比较窦性心律人群和房颤患者粪便双歧杆菌水平，旨在探讨双歧杆菌是否为房颤发生发展的重要影响因素。

1 对象和方法

1.1 研究对象

纳入2019年6月至2019年9月在哈尔滨医科大学附属第一医院就诊的房颤患者70例为房颤组，平均年龄为(56.0±11.2)岁，选择同期就诊的年龄、性别和体质指数等匹配的窦性心律者70例为对照组，平均年龄为(54.0±10.4)岁。纳入标准：窦性心律者和确诊房颤患者。房颤诊断根据《2014年欧洲房颤管理指南》[8]：本研究纳入阵发性房颤患者31例，持续性房颤患者39例。窦性心律者：既往无房颤病史，且住院期间十二导联心电图或Holter检查无房颤发作的窦性心律者。排除标准：既往心力衰竭、冠心病和结构性心脏病病史患者、合并炎症性肠病、肠易激综合征、自身免疫性疾病、肝病、肾脏疾病或癌症患者、过去1个月内使用抗生素或益生菌患者。本研究通过伦理委员会批准，并获得患者书面知情同意书。

1.2 资料收集

收集患者新鲜粪便样本，并记录患者基本信息，包括一般情况(年龄、性别和体质指数)、基础疾病(高血压和糖尿病)、化验指标(总胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白胆固醇、空腹血糖和尿酸)、超声心动图(左房内径和左室射血分数)和药物使用情况(血管紧张素转化酶抑制剂、血管紧张素受体拮抗剂、β受体阻滞剂、他汀、阿司匹林、胺碘酮和口服抗凝药)。

1.3 检测方法与试剂

使用无菌管收集所有患者新鲜粪便样本，使用粪便基因组DNA提取试剂盒(天根生物科技有限公司，DP328-02)提取粪便样本DNA，取180～220 mg粪便样本于2 ml离心管中，加入500 μl缓冲液SA，100 μl缓冲液SC，15 μl Proteinase K，0.25g研磨珠进行研磨和充分裂解，再进行吸附和漂洗，最后悬空滴加50 μl洗脱缓冲液TB，室温放置2～5 min，12 000 rpm离心2 min，将溶液收集至离心管，即得到基因组DNA样本。使用荧光定量PCR仪(ABI)进行扩增检测粪便中DNA表达量。扩增程序设置为：最初一个循环95 ℃持续20 s，然后95°C持续20 s，55°C持续20 s和72°C持续50 s，进行40个循环，最后一个循环95°C持续50 s。设置CtA1为1号样本目标基因的Ct值，CtB1为1号样本内参基因的Ct值，CtA2为2号样本目标基因的Ct值，CtB2为2号样本内参基因的Ct值，则1号样本和2号样本目标基因表达水平可以大致计算为(2-ddCt)：ddCt=(CtA2-CtB2)-(CtA1-CtB1)=X，则2号样本目标基因的表达1号样本的2-X倍。

1.4 PCR引物信息

本研究选择Bifidobacterium菌属的四种菌群进行研究，本研究中所用的全部引物序列均由Primer 5.0软件设计，购买于Life & Technology公司。引物序列详见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 窦性心律和房颤患者基本资料

两组患者一般情况、基础疾病、化验指标和左室射血分数的差异均无统计学意义(均为P>0.05)。与窦性心律组相比，房颤组患者左房内径增加(P<0.001)，见表2。

表2 两组患者基本临床资料

2.2 qRT-PCR检测窦性心律组和房颤组患者双歧杆菌

对70例窦性心律患者和70例房颤粪便样本进行qRT-PCR发现，房颤组患者Bifidobacteriumadolescentis(t=0.94，P>0.05)和Bifidobacteriumbifidum(t=0.48，P>0.05)差异无统计学意义，但Bifidobacteriumanimalisssp.lactis(t=3.48，P<0.001)和Bifidobacteriumbreve(t=6.54，P<0.001)表达明显降低。

2.3 qRT-PCR检测阵发性房颤组和持续性房颤组患者双歧杆菌

进一步将房颤患者分为阵发性房颤(31例)和持续性房颤(39例)，对两组患者菌群进行比较发现，与阵发性房颤患者相比，持续性房颤患者Bifidobacteriumanimalisssp.lactis(t=3.27，P<0.01)和Bifidobacteriumbreve(t=6.54，P<0.001)明显降低。

2.4 双歧杆菌与房颤的相关性分析

单因素logistic回归分析结果显示，左房内径(OR=1.43，95%CI：1.24～1.69，P<0.001)、Bifidobacteriumanimalisssp.lactis(OR=0.13，95%CI：0.04～0.73，P<0.01)和Bifidobacteriumbreve(OR=0.05，95%CI：0.009～0.67，P<0.001)与房颤具有显著相关性。多因素logistic回归分析结果显示，左房内径(OR=1.54，95%CI：1.22～1.89，P<0.001)、Bifidobacteriumanimalisssp.lactis(OR=0.47，95%CI：0.18～0.97，P<0.01)和Bifidobacteriumbreve(OR=0.23，95%CI：0.12～0.98，P<0.001)与房颤独立相关。

3 讨论

房颤是临床最常见的一种心律失常之一，其发病率高达1%～2%。房颤发病机制尚不完全清楚，目前仍缺乏有效防治措施。Zuo等[9]对50例窦性心律和50例房颤患者行宏基因组和代谢组学分析发现，与窦性心律者相比，房颤患者肠道微生物多样性显著增加，菌群组成发生显著改变，菌群代谢物也发生明显改变，提示肠道菌群和房颤密切相关。双歧杆菌是机体常见的有益菌，在维持肠道稳态和机体健康中发挥重要作用。本研究结果表明，与窦性心律患者相比，房颤患者双歧杆菌丰富减低；与阵发性房颤患者相比，持续性房颤患者降低更显著，提示双歧杆菌丰度和房颤及房颤临床分型有关，且多因素Logistic回归分析显示双歧杆菌丰富降低是房颤发生的独立危险因素。

人体由真核细胞与体内共生的微生物群落共同组成，绝大多数微生物群落位于肠道黏膜层，被称为肠道菌群。近年来大量研究证实，肠道菌群除可调节营养物质吸收、能量代谢外，还参与免疫反应等生物学过程，对人体健康状态发挥重要作用[10]。双歧杆菌是一种重要有益肠道菌群，能抑制有害细菌生长，抵抗病原菌感染。此外，双歧杆菌可产生醋酸、丙酸、丁酸和乳酸等代谢产物，从而维持肠道屏障功能稳定，对机体固有免疫发挥重要调控作用[11]。大量研究证实，炎症是重要危险因素，炎症标志物与房颤的发生、维持、复发及血栓形成等均密切有关[12]。与窦性心律人群相比，房颤患者循环C反应蛋白等炎症因子水平显著增加[13]。促炎因子白介素6(interleukin 6，IL-6)，被认为与房颤发生发展密切相关[14]。一项随机对照研究发现，与口服安慰剂患者相比，围术期患者口服双歧杆菌补充剂循环IL-6水平显著降低[15]。提示双歧杆菌可降低循环IL-6水平，减轻炎症反应。故双歧杆菌丰度降低是房颤发生独立危险因素主要原因之一。此外，本研究发现，左房内径与房颤发生发展密切相关。与既往研究结果一致[16]。Framinghan研究发现，与左房内径≤35 mm患者相比，左房内径≥44 mm患者房颤发生风险增加2.5倍。对15例既往无器质心脏疾病的房颤患者进行随访发现，2年后左心房容积从45.2 cm3增加至64.1 cm3。提示左房内径增大与房颤密切相关。

本研究存在一定的局限性：本研究样本量小，存在选择偏倚，且仅针对双歧杆菌进行检测，未对粪便其它细菌进行检测，并不能代表房颤患者肠道菌群的全面改变。此外，后续还需要对双歧杆菌进行功能学实验。

综上所述，肠道菌群参与调控房颤发生发展，及时干预菌群稳态可能有助于房颤防治。双歧杆菌作为一种有益菌，其丰度降低是房颤的重要危险因素，且与房颤临床分型有关。但本文仅证明了肠道双歧杆菌和房颤的相关性，基于肠道菌群的干预策略对改善房颤的临床价值尚需深入研究。

利益冲突：无