黄连素对脂肪细胞脂联素分泌的影响及分子机制

夏文燕 蓝金花 许 荣 吕维名

（赣南医学院第一附属医院，江西赣州 341300）

脂联素是脂肪细胞分泌的脂肪细胞因子，其分泌量与肥胖和胰岛素抵抗呈负相关[1]。高糖环境可诱发内质网应激（Endoplasmic reticulum stress，ERs）[2]，损伤脂肪细胞的分泌功能。目前研究证实，黄连素是一种异喹啉类生物碱，可以改善脂联素的分泌，调节糖脂代谢[3]。但国内外尚未有关于黄连素对高糖介导的3T3-L1 脂肪细胞内质网应激对脂联素分泌的影响及具体机制的报道。本研究探讨黄连素对高糖介导的3T3-L1 脂肪细胞内质网应激对脂联素蛋白分泌的影响，并进一步探讨是否通过下调内质网应激蛋白PERK/eIF2a水平改善脂联素的可能分子机制，结果如下。

1 资料与方法

1.1 主要试剂

3T3-L1前 脂 肪 细 胞 株（American Type culture collection，ATCC）；高糖（DMEM）培养基（ DMEM 美国 GIBCO 公司）；高糖无酚红（DMEM）培养基（美国 Sigmag公司）；胎牛血清（美国 GIBCO 公司）；地塞米松（DEX，D4902）（美国 SIGMA 公司）；胰岛素（若和灵 R）（丹麦诺和诺德公司）；黄连素购于上海康九化工有限公司；葡萄糖购自北京益利精细化学品有限公司；兔抗人eIF2a 单克隆 抗体（美国BPB公司）；蛋白激酶R样内质网激酶（PERK），（1∶200稀释，美国Santa Cruz），p-PERK（1∶1 000稀释，美国Santa Cruz）及脂联素抗体（武汉博士德公司）。

1.2 方法

1.2.1 3T3-L1前脂肪细胞的诱导分化 3T3-L1前脂肪细胞用10%的胎牛血清高糖DMEM培养液，在 37 ℃、7% CO2培养箱中培养。细胞融合率达到 80%～90% 时，用胰蛋白酶（0.25%）消化并传代于6孔培养板上。待细胞融合后，加含1μmol/L地塞米松和0.5 mmol/L 1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤及10μg/mL 胰岛素的DMEM培养液培养48 h；以含10μg/mL 胰岛素的DMEM培养液再培养48 h，以DMEM培养液继续培养6 d，10 d左右的诱导分化90%3T3-L1细胞呈脂肪细胞表型，细胞内见脂滴。

1.2.2 3T3-L1脂肪细胞分组 将3T3-L1脂肪细胞分三组，每组用无血清培养液预处理 6 h同步化后，设对照组，高糖组，高糖+黄连素组（黄连素组）。对照组不加任何处理，温育24 h；高糖组加入葡萄糖至终浓度25.5 mmol/L，温育24 h；在黄连素组加入黄连素（20 umol/L）和高糖（25.5 mmol/L），温育24 h。

1.2.3 Western blot 检测蛋白的表达 总蛋白样品用SDSPAGE电泳分离后转移至PVDF膜，以5%脱脂奶粉封闭，加入p-PERK、PERK、eIF2a、脂联素、actin多克隆抗体孵育至少12 h，洗涤，加入标记辣根过氧化酶（HRP）的II抗室温孵育1 h，再洗涤。用ECL显影剂显影，以激光扫描仪进行定量扫描。

1.3 统计学分析

采用SPSS 20.0软件进行数据统计分析，计量资料以（）表示，采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 黄连素组抑制高糖诱发的 3T3-L1 脂肪细胞内质网应激元件蛋白表达

结果显示，高糖组中内质网应激蛋白p-PERK、eIF2a分别与对照组、黄连素组相比，差异有统计学意义（P＜0.01），见图1-3。

2.2 黄连素和高糖对脂肪细胞脂联素的影响

用 Western blot 检测脂联素蛋白水平，高糖组与对照组比，差异有统计学意义（P＜0.01），黄连素组与高糖组比，差异有统计学意义（P＜0.01），见图4-5。

3 讨论

脂联素为脂肪细胞分泌因子中的代表性成员，为脂肪细胞特异性分泌。脂联素在调节糖脂代谢的稳态中发挥重要作用，有研究证实，在脂联素敲除大黄鱼中出现明显的胰岛素抵抗、肥胖[4]。脂联素转基因的小鼠即使采用高脂喂养，却可明显抑制脂肪细胞的肥大、脂肪组织炎症等，在肝脏中脂联素可以抑制糖异生，改善非酒精性脂肪肝的形成[5]。脂联素的减少对代谢综合症的发生发展有重要意义。故研究药物能否抑制脂联素的下降及作用靶点具有重要意义。

此外，内质网应激参与糖脂代谢紊乱的重要地位已被证实[6]。内质网应激导致未折叠和错误折叠的蛋白在内质网上堆积增多，并启动未折叠蛋白反应（UPR）。内质网应激蛋白至少包括三个定位在内质网膜上出现在胞浆内质网腔域的直接信号成员，包括PERK，（ATF）6，IRE1[7]。PERK是内质网上的丝苏氨酸蛋白激酶，可以激活下游的真核生物翻译启动因子2 a亚组（eIF2a），eIF2a活化后随后抑制蛋白的合成并防止新生蛋白进一步流入饱和的内质网腔中，保护细胞，但随着内质网应激的延长，使得通路激活其它信号分子，参与疾病的病理变化，促进细胞受损及凋亡。持续高糖环境可诱发脂肪细胞内质网应激，导致脂肪细胞分泌功能紊乱。研究证实高糖可诱发内质网应激元件PERK磷酸化并通过eIF2a途径引诱各种抗氧化物的生成。本研究结果发现，经高糖处理后，p-PERK和eIF2a蛋白水平增高，显著高于对照组。此外，本研究发现，高糖（25 mmol/L）可以抑制脂联素的分泌，提示高糖有可能通过激活内质网应激通路PERK和eIF2a来抑制脂联素的分泌。

黄连素是一种天然植物提取物，毒副作用小，价格便宜，对改善糖脂代谢有明显疗效，是潜在的治疗糖尿病的药物。已有研究证实[8]，黄连素可以抑制大鼠骨骼肌的内质网应激相关蛋白，改善胰岛素抵抗。在本研究中，结果提示黄连素处理后，内质网应激元件PERK、eIF2a蛋白水平减少，脂联素分泌上调，其蛋白水平与高糖组有显著差异（P＜0.05），这提示黄连素可能参与了抑制高糖激活的内质网应激通路PERK/eIF2a来上调脂联素的分泌，发挥改善胰岛素抵抗的作用。

综上所述，高糖可抑制脂联素的分泌，黄连素可以改善高糖诱发的脂肪细胞的这种分泌异常，并可能通过抑制内质网应激PERK/eIF2a通路来抑制高糖所诱发的脂联素下降。了解作用靶点和机制可为临床用药提供相关依据，但是否还有其它机制共同调节还有待进一步研究。