脂多糖调控对大鼠心脏微血管内皮细胞的转录组分析

岳影星 杨舟鑫 卢艳 严静,

脓毒症是指宿主对感染反应失控而导致的危及生命的器官功能障碍[1]。其中，心脏功能障碍是导致脓毒症患者死亡的重要因素之一[2]。目前对脓毒症状态下心脏变化的认识仍然比较初步，但在发生脓毒症时，心肌组织的局部炎症被认为是脓毒症心功能异常的关键因素之一。脓毒症状态下，心脏组织会发生免疫细胞的浸润，这些免疫细胞分泌高水平的炎症因子如TNF-α 和IL-1β，从而影响心脏的生理功能[3]。

内皮功能改变是脓毒症状态下心肌炎症的重要诱因，而大鼠心脏微血管内皮细胞（rat cardiac microvascular endothelial cells，rCMECs）状态的变化被认为是脓毒症内皮功能改变的关键。在正常状态下，心脏内皮细胞可以起到很好的屏障作用；但是在脓毒症状态下，心肌内皮细胞的屏障作用降低，炎症细胞进入心肌组织而导致心脏功能异常[4]。除了屏障作用之外，内皮细胞在病原微生物和炎症因子的刺激下，分泌趋化因子和黏附蛋白，吸引和协助炎性细胞进入组织中[5-6]。因此，对于rCMECs 在脓毒症中变化的研究对于脓毒症心肌保护具有重要的意义。本文对革兰氏阴性细菌细胞壁关键成分脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）处理的rCMECs细胞模型进行了的转录组分析，从全局的角度探索了脓毒症rCMECs 的变化，以期为脓毒症心肌保护提供新的提示。

材料与方法

一、材料

1.实验动物：1月龄的雄性SD大鼠10只，SPF级别饲养，体质量（100±5）g，质量合格证编号：NO1612060018，从浙江省医科院动物实验中心购买。

2.试剂：内皮细胞完全培养基（含有双抗，内皮细胞生长添加剂和胎牛血清，基础培养基为M199 培养基）（武汉普诺赛生命科技有限公司）；Ⅱ型胶原酶和LPS（美国Sigma公司）；磷酸盐缓冲液（phosphate buff er solution，PBS）和0.25%胰酶+0.02%EDTA溶液（杭州吉诺生物医药技术有限公司）；Trizol（美国Thermo公司），miRNeasy Mini Kit（德国Qiagen公司），Next rRNA Depletion Kit（英国NEB公司），ReverTra Ace qPCR RT Kit 和SYBR Green Realtime PCR Master Mix（日本TOYOBO公司）。

二、方法

1.rCMECs 的分离培养：根据课题组以前的方案分离rCMECs[7]。1月龄雄性SD 大鼠处死后打开胸腔，取出心脏，使用PBS 清洗心脏并排出血液。取出心脏组织，弃去结缔组织，放入75 %酒精中浸泡30 s 然后泡入完全培养基。使用剪刀尽量减碎心脏组织，用PBS 清洗，加入两倍体积0.2 %Ⅱ型胶原酶，37℃恒温振荡15 min，加入相同体积的完全培养基终止反应，用200 目滤网过滤，300×g离心5 min，PBS 清洗1次，然后接种到1 %明胶包被的6 cm 的培养皿中，加入完全培养基，放入含有5 %CO2的37℃培养箱中培养。培养2 h后换液，去掉没有贴壁的细胞。培养5 d 左右细胞融合度＞ 80 %。消化时使用含0.02 %EDTA 的0.25 %胰酶消化，消化至细胞即将脱落的状态时，加入1 mL 完全培养基终止反应。然后加入3 mL 的PBS，用移液器反复吹打细胞至大部分细胞从培养皿脱落。300×g离心5 min后弃去上清液，加入内皮细胞完全培养基重悬细胞，按照1:3 的比例传代扩增。实验使用3 代以内的rCMECs。

2.LPS 处理rCMECs：消化rCMECs，每孔接种3×105个细胞至6 孔板，贴壁培养24 h后，按终浓度100 ng/mL 加入LPS。对照组和LPS 各有3个生物学重复。根据文献报道LPS 处理6 h 的内皮细胞有多个指标具有较显著的变化[8]，因此选择LPS 处理rCMECs 6 h，弃去上清后用PBS 清洗1遍后，加入trizol 吹打几次后放入-80℃冰箱用于后续转录组测序或者定量PCR。

3.转录组测序：转录组测序在上海金特达公司进行。总RNA 使用miRNeasy Mini Kit 提取，然后使用Next rRNA Depletion Kit 来去除核糖体RNA。RNA 测序是在Illumina 的HiSeq X-Ten nextgeneration 上进行。采用STRINGTIE 软件计算每个基因测到的计数。本文主要关注mRNA，DESeq 软件用来计算差异基因。

4.GO 和KEGG富集和基因共表达网络分析：上调基因和下调基因的基因本体论（Gene Ontology，GO）富集分析和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）富集分析是使用基于R 语言的The Hypergeometric Distribution 来进行。将GO富集中P值最小的前10个关于生物学过程（biological processes）、细胞组分（cellular component）和分子功能（molecular function）的富集以及KEGG富集中P值最小前20个的通路以图的形式展示。基因共表达网络是通过差异基因的结果及其表达值构建，并分析这些基因的表达调控。

5.RNA 逆转录和定量PCR：使用Rever Tra Ace qPCR RT Kit 进行mRNA 逆转录，然后使用SYBR Green Realtime PCR Master Mix 进行定量PCR 分析。定量PCR 时使用Gapdh 的表达量作为内参。计算目的基因与Gapdh 的ΔCt 值，然后按照2-ΔCt法计算目的基因的相对表达量。（表1）

三、统计学分析方法

采用GraphPad Prism 8.0 软件进行统计学分析。Mt2a、Sod2、Ccl2、Cxcl1、Icam1、Vcaml基因的mRNA表达水平以x± s表示，采用独立t检验，以P＜ 0.05 为差异具有统计学意义。

结 果

一、LPS 处理调控了心肌功能相关基因的改变

分析了其中编码蛋白质的mRNA 的变化。在LPS 处理下，有265个基因被检测到表达上调，有118个基因的表达下调（图1）。最显著上调前10个 基 因 为：Mt2a、Cyp7b1、Sod2、Icam1、Ccl2、AC128848.1、Mt1、Cebpd、Serpinb2和Tnfrsf11b。最显著下调前10个基因为：Cavin2、Ankrd1、Edn1、Prss35、Lmod1、Dhrs3、Ttc22、Sema6a、Map2k3和Sema7a。上调基因中，选择了与氧化应激（Mt2a、Sod2）、趋化因子（Ccl2、Cxcl1）和细胞表面黏附（Vcam1、Icam1）相关的几个基因进行了定量PCR验证。定量PCR 的结果表明这几个基因在LPS 的处理下均上调，与测序的结果相符。下调基因中，选择了Cavin2、Ankrd1、Edn1和Prss35进行了验证，定量PCR 的结果表明这几个基因均下调。（表2）

表1 引物序列信息

图1 转录组测序结果火山图

二、差异基因GO富集分析

上调基因从生物学角度，前3个是对LPS 的反应、对细菌来源分子的反应和细胞运动的正调节。而从细胞内成分角度，前3个是I-κB/NF-κB 复合物、核周体和质膜外侧。从分子功能的角度，上调基因前3个富集是趋化因子活性、趋化因子受体结合和细胞因子活性。（图2）

对于下调的基因，从生物学过程角度，GO富集最显著的是磷脂酶C 激活G蛋白偶联信号通路中胞质钙离子浓度的正调控、钙离子稳态和胞质钙离子浓度的正调节。而从细胞内成分角度，GO富集中P值最小的3个是基底外侧质膜、蛋白质细胞外基质和胰岛素样生长因子结合蛋白复合物。从分子功能的角度，前3个是G蛋白偶联受体结合、睾酮脱氢酶（NAD+）活性、G蛋白β 亚单位结合。（图3）

三、差异基因KEGG 功能分析

上调基因KEGG富集前3个是肿瘤坏死因子信号通路、NF-κB 信号通路和病毒蛋白与细胞因子和细胞因子受体的相互作用。（图4）

表2 差异基因定量PCR 验证（± s）

表2 差异基因定量PCR 验证（± s）

注：对照组Ankrd1，Edn1 的实验次数为2次

分组 实验次数 Mt2a Sod2 Ccl2 Cxcl1 Icam1对照组 3 0.084473±0.004400 0.007357±0.000623 0.000378±0.000039 0.001666±0.000144 0.019167±0.002541 LPS 组 3 1.445459±0.372817 0.076643±0.003449 0.084866±0.004514 0.239796±0.027300 0.075535±0.006341 t 值 6.322 34.230 32.410 15.110 14.290 P 值 0.003 ＜ 0.001 ＜ 0.001 0.001 0.001分组 实验次数 Vcaml Cavin2 Ankrd1 Edn1 Prss35对照组 3 0.000021±8.48873E-06 0.041950±0.018844 0.115589±0.014128 0.026018±0.007298 0.001844±0.000018 LPS 组 3 0.002501±0.000030 0.009144±0.000279 0.057983±0.003549 0.005615±0.001817 0.000632±0.000297 t 值 137.200 3.015 7.290 5.003 5.472 P 值 ＜ 0.001 0.039 0.005 0.015 0.012

图2 上调基因GO富集分析

图3 下调基因GO富集分析

下调基因KEGG富集前3个是神经活性配体-受体相互作用、黑色素生成和肌醇磷酸盐代谢。（图5）

四、差异基因共表达网络分析

如图6所示，SOD2 处于差异基因共表达网络的核心位置，其可能在LPS 诱导的rRCMECs 功能改变中有关键性的调节作用。

讨 论

LPS 体外刺激实验方法，被认为是可以用来模拟革兰氏阴性菌感染下的细胞的变化情况，而一般研究较多的是巨噬细胞炎症反应。本研究结果表明，在LPS 处理后，大鼠心脏微血管内皮细胞大量基因的表达发生了变化，很多与氧化应激、趋化因子和细胞表面黏附相关的基因的表达都明显上调。利用生物信息学技术的分析，本研究发现LPS 诱导的基因表达变化确实与心脏内皮功能紊乱有密切的相关性。与其他细胞受到LPS 刺激后一样，rCMECs上调了大量与NF-κB 信号通路有关的基因表达，如Cxcl1、Nfkbia、Vcam1、Icam1等基因的表达都明显上调。与利用LPS 处理巨噬细胞实验不一样的是，本实验并没有发现炎症因子Tnf和Il6表达的明显变化。通常认为分泌炎症因子并非内皮细胞的主要功能，反而是趋化因子、黏附分子的上调对于内皮细胞功能的改变具有更加重要的意义。CXCL1 和CCL2两个趋化因子在基因表达水平有明显的上升，其中CXCL1 是一种粒细胞的趋化因子[9]，CCL2 是一种重要的单核细胞趋化因子[10]。VCAM1 和ICAM1是细胞表面重要的黏附分子，对淋巴细胞、单核细胞或粒细胞有黏附作用，它们的基因表达也显著上升[11-12]。这些改变与内皮细胞在脓毒症状态下的改变一致，即内皮细胞分泌趋化因子可以吸引炎性单核细胞、中心粒细胞和淋巴细胞到血管内皮周围，然后通过表面的黏附分子黏附这些细胞并转移到组织中从而引起组织的炎症反应。

图4 上调基因KEGG富集分析

对于下调基因的分析表明，钙离子信号和G蛋白相关通路的基因表达明显下调，这两个通路被认为可能与细胞骨架形成有密切的关联[13-14]。在正常生理状态下，内皮细胞可以依靠骨架蛋白呈现特定的形态；但是在脓毒症引发的内皮损伤过程中，细胞骨架蛋白的结构被破坏。同时钙离子信号也是VE-cadherin 重要的调节信号，脓毒症状态下VE-cadherin 的内化会导致心脏微血管内皮细胞依靠VE-Cadherin 形成的嗜同性结合被破坏[15]。细胞骨架蛋白和VE-cadherin 的异常，会导致rCMECs 之间的间隙变大，内皮通透性增加而引起炎症细胞浸润[16]。

这些结果说明内皮很多功能改变可以直接由LPS 诱导产生，而不依赖于炎症因子的持续高表达。在脓毒症的发生发展过程中，循环中的炎症因子并非持续高表达；即使进入了脓毒症后期免疫抑制状态，内皮功能仍会有异常，这一临床和动物层次的表现与本文的结果有很好的一致性。感染状态下病原微生物除了刺激免疫细胞，对内皮细胞的直接刺激也是脓毒症发生发展的关键环节之一。

对差异基因共表达网络分析表明Sod2处于核心位置。Sod2即人超氧化物歧化酶-2，可以催化超氧化物为过氧化氢，是降低体内活性氧的关键酶之一，而高活性氧也是脓毒症发生发展过程中对机体造成损伤的关键因素之一。在LPS 处理后，rCMECs 中Sod2基因表达的上升也是对活性氧上升的一种反应。然而，Sod2处于差异基因共表达网络的核心位置说明它可能影响了rCMECs 中很多生物学过程。其具体的作用可能需要进一步的功能研究。总之，本文从全局的角度对LPS 诱导的rCMECs 进行了转录组分析，发现LPS 可以调控氧化应激、趋化因子和黏附分子等相关基因的表达，且基因共表达网络的分析提示Sod2可能是心肌功能异常的关键调节基因。本研究的结果为脓毒症状态下内皮损伤的研究提供了新的线索。

图5 下调基因KEGG富集分析

图6 差异基因共表达网络图