线粒体相关内质网膜在肠缺血再灌注损伤中的研究进展

丁可，孙涛，潘锐，景祎馨，张贻帼，孟庆涛

武汉大学人民医院麻醉科，武汉430060

肠缺血再灌注损伤是由疾病、外科手术等多种原因导致肠组织血供不足，并在恢复血供后损伤反而进一步加重的病理生理过程。肠缺血后再灌注不仅可导致肠道结构和功能改变，还会引起肝、肺、肾等远隔脏器损伤。肠缺血再灌注后肠上皮细胞经历缺氧—复氧过程，细胞内氧化应激水平增加，线粒体功能紊乱，三磷酸腺苷（ATP）产生不足，致使活性氧（ROS）在细胞内积聚。此外，肠缺血再灌注后肠黏膜通透性增加，致使肠道内的细菌或毒素进入血液循环，引起全身炎症反应综合征，甚至多器官功能障碍综合征［1］。线粒体相关内质网膜（MAM）是线粒体与内质网之间的动态结构，可调节线粒体和内质网功能。越来越多证据表明，MAM在能量产生、细胞收缩和运动、细胞内外信号传递中具有重要作用，能够参与线粒体ROS产生和积聚、下游炎症因子释放、自噬调控、内质网应激以及细胞程序性死亡等生物学过程［2］。近年研究发现，MAM参与的细胞事件和肠缺血再灌注后发生的细胞事件高度重合。因此，了解MAM在细胞内的功能将为肠缺血再灌注损伤治疗提供新的方向。本文结合文献就MAM在肠缺血再灌注损伤中的研究进展作一综述。

1 MAM概述

SHORE等［3］通过电子显微镜观察发现，线粒体与内质网的共沉淀以及线粒体与内质网囊泡之间的联系紧密，提出了线粒体与内质网之间存在密切的生物学调控机制。内质网是细胞内信息交流的中转站，内质网小管是脂质合成和信号传导的主要区域。线粒体是细胞代谢和细胞程序性死亡等过程中必不可少的细胞器，线粒体变化可影响许多细胞事件的发生和发展。有研究证实，MAM是由内质网和线粒体外膜的膜碎片构成［4］。电子计算机断层扫描显示，内质网和线粒体由在光滑内质网大约10 nm处或粗糙内质网大约25 nm处的系链相连［5］。内质网—线粒体系链结构由多种蛋白质构成，如线粒体融合蛋白（Mfn）、1，4，5-三磷酸肌醇受体（IP3R）、电压依赖性阴离子通道（VDAC）、葡萄糖调节蛋白75（GRP75）、酪氨酸磷酸酶相互作用蛋白51（PTPIP51）、囊泡膜相关蛋白B（VAPB）、PTEN诱导的假定激酶1（PINK1）等［6］。MAM是线粒体和内质网之间形成的物理连接，其形态学和蛋白表达变化会影响线粒体的生物学功能，从而导致神经退行性疾病或代谢性疾病的发生、发展［7］。

2 MAM中参与肠缺血再灌注损伤相关的蛋白质

蛋白质是机体内各种生物学功能的直接执行者。在线粒体和内质网之间的MAM上存在或通过招募各种蛋白质定位到MAM上，从而介导细胞内信号传导或物质转运［8］。MAM上的蛋白质在内质网和线粒体之间的物理连接中起直接作用，或调节MAM上的系链复合物间接调控生物学功能［6］。在MAM上参与肠缺血再灌注损伤的重要蛋白质或蛋白 质 结 构 有IP3R-GRP75-VDAC、VAPB-PTPIP51、Mfn、FUNDC1、PINK1、BECN1。

2.1 IP3R-GRP75-VDAC 内质网是细胞内Ca2+的存储场所，能够通过释放或回收Ca2+来响应细胞内电刺激或化学刺激。Ca2+介导的信号传导有利于细胞对外界刺激做出快速反应，从而维持自身的稳态。线粒体是细胞内能量代谢的细胞器，Ca2+则是线粒体氧化呼吸链中多种酶的激动剂，能够决定ATP的生成速度。IP3R是内质网膜上的Ca2+通道，可介导Ca2+从内质网膜上释放至细胞质和线粒体。VDAC是细胞内最丰富的线粒体外膜通道，能够调控代谢物进入和流出线粒体，从而广泛参与调节代谢物和ROS水平以及内质网与线粒体之间的信号传导。IP3R和VDAC一起介导Ca2+从内质网释放并转运至线粒体。VDAC和IP3R通过与GRP75相互作用，调节线粒体和内质网之间的钙平衡，这是维持线粒体生物能量所必需的［9］。细胞色素C在Bcl-2下游凋亡通路激活后从线粒体内释放，可与MAM上的IP3R结合，进一步激活Ca2+转运，从而增强凋亡信号［10］。IP3R-GRP75-VDAC通过促进线粒体Ca2+超载来介导细胞凋亡，而抑制Ca2+从内质网向线粒体转移的拮抗剂能够保护小鼠足细胞免于凋亡［11］。VDAC还能与Bcl-2家族的许多促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白相互作用，从而在细胞凋亡中发挥重要作用［12］。VDAC开放还可引起Ca2+大量流入线粒体，使线粒体膜电位增加，从而引起线粒体ROS生成和氧化应激诱导的细胞死亡。在缺血和再灌注过程中，Ca2+超载和细胞凋亡是组织损伤的重要原因。肠缺血再灌注后，通过调控IP3R-GRP75-VDAC，能够使Ca2+内流减少，避免线粒体Ca2+超载、减少细胞内ROS积聚，在一定程度上减轻肠缺血再灌注损伤。

2.2 VAPB-PTPIP51 VAPB是一种内质网蛋白，富集于MAM上。PTPIP51是一种氨基末端锚定的线粒体外膜蛋白。VAPB与PTPIP51相互作用可促进IP3R/VDAC介导的内质网—线粒体接触传递Ca2+，对于维持线粒体内钙稳态具有重要作用。MAM被证实是自噬小体生物发生的位点［13］。VAPB或PTPIP51缺失可导致IP3R/VDAC相互作用减少，从而影响线粒体Ca2+摄取，进而刺激自噬发生［14］。敲除VAPB或PTPIP51可导致内质网—线粒体系链结构松弛，抑制线粒体与内质网之间的Ca2+交换，从而诱导自噬体形成；而VAPB或PTPIP51过表达则可导致内质网—线粒体系链结构更加紧密，MAM的空间距离减小，线粒体与内质网之间的Ca2+交换增加，从而抑制自噬体形成［14］。线粒体自噬是保护线粒体功能、维持细胞内正常能量供应的重要方式。肠缺血再灌注后细胞内自噬水平紊乱，VAPB-PTPIP51通过调节线粒体和内质网之间的距离，增加或减少自噬发生。此外，在siRNA沉默VAPB或PTPIP51的细胞中，使用人工系链可以抵消VAPB或PTPIP51沉默对细胞自噬的影响［14］。因此，通过影响VAPB-PTPIP51结构来控制线粒体自噬水平，能够保护或减轻肠缺血再灌注带来的组织损伤。

2.3 Mfn 线粒体通过融合和分裂来维持细胞内数量及能量平衡，这种线粒体动态平衡可影响细胞内能量供应和细胞分裂、凋亡以及自噬［15］。线粒体融合使线粒体之间交换一些组分，使有缺陷的线粒体重新获得呼吸链和线粒体DNA的必需成分，从而使细胞免于凋亡并保护线粒体免于自噬。线粒体分裂可影响线粒体网络的重塑和重排以及线粒体运输，促进细胞凋亡以及清除功能异常的线粒体。在哺乳动物中，线粒体外膜的融合依靠Mfn，线粒体内膜的融合则由OPA1介导。Mfn包括Mfn1和Mfn2，二者均为线粒体外膜上的跨膜GTPases，它们在相邻线粒体之间形成复合物并介导外膜融合［16］。Mfn1是线粒体融合的系链蛋白，可与OPA1相互作用，从而在线粒体融合中发挥重要作用［17］。GTP能够触发Mfn从折叠状态至展开状态，两个线粒体上被GTP激活的Mfn相互靠近可形成反式二聚体结构，从而使相对的线粒体外膜相互靠近，继而完成线粒体融合［18］。Mfn可以稳定相邻线粒体之间的相互作用，调节线粒体形态，稳定线粒体和内质网之间的相互联系。在肠缺血再灌注后，线粒体功能紊乱，Mfn1促进线粒体融合，以修复损伤的线粒体，维持细胞内氧化还原平衡。Mfn2的活性受转录调节因子Smad2和鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF）、Ras Interactor 1（RIN1）的调控。Smad2是RIN1与Mfn2结合形成复合物的关键蛋白，Smad2-RIN1-Mfn2复合物使RIN1充当Mfn2-GTPase活化的GEF，从而促进线粒体融合［19］。Mfn2对线粒体至关重要，在细胞缺少能量，如缺血、缺氧时，能够维持细胞存活［20］，是肠缺血再灌注后的保护性蛋白。有研究发现，Mfn2缺失可降低心肌细胞对缺血再灌注的反应性死亡，从而降低了钙依赖性线粒体通透性转变（MPT）的可能性［21］。MPT是由线粒体通透性过渡孔（mPTP）介导的严格调控过程，而mPTP是一种高电导的钙敏感性通道，在开放时会引起线粒体去极化和功能障碍。在缺血和再灌注期间，mPTP开放导致线粒体膜电位变化，从而影响线粒体ATP生成效率，而严重的组织损伤还可导致线粒体DNA（mtDNA）通过mPTP渗漏至细胞质甚至血液，引起局部或全身炎症反应。因此，调控Mfn表达，稳定线粒体网络，减少mtDNA渗漏，能够减轻肠缺血再灌注损伤。

2.4 FUNDC1 MAM不仅是线粒体自噬小体形成的位点，还是线粒体分裂的位点。FUNDC1是一种位于哺乳动物细胞线粒体外膜上的三跨膜蛋白。FUNDC1具有一个与LC3相互作用的区域（LIR），能够通过与线粒体相互作用并招募LC3，从而介导局部缺血诱导的线粒体自噬。有研究发现，在缺血缺氧过程中FUNDC1会作为线粒体自噬受体在线粒体外膜上表达［22］。线粒体自噬是一种特殊的自噬形式，能够选择性地清除受损的线粒体，以应对包括缺氧、ROS积聚和呼吸链抑制剂在内的多种刺激［23］，在肠缺血再灌注后清除功能紊乱的线粒体，保证细胞内营养物质的合理利用和能量的正常供应。FUNDC1能够调节线粒体裂变和线粒体自噬，并介导跨双膜的偶联，以此进行线粒体动力学和质量控制［24］。线粒体在被吞噬体吞噬之前需要被碎片化，而线粒体碎片化是线粒体融合和分裂不平衡的结果。在缺血性脑卒中后添加外源性tPA会导致AMPK磷酸化和FUNDC1表达增加，随后FUNDC1通过LIR与LC3结合，导致自噬双层膜包裹线粒体，诱导线粒体自噬，从而起到神经元保护作用［25］。肠缺血再灌注后，线粒体外膜上表达FUNDC1的数量决定了线粒体自噬程度，适度线粒体自噬能够增加细胞对应激的抗性，从而起到脏器保护作用。

2.5 PINK1 在线粒体自噬过程中，自噬体形成需要PINK1。PINK1编码线粒体蛋白激酶，可调节线粒体形态、运输功能以及线粒体内Ca2+含量，影响复合体Ⅰ活性和ATP生成。PINK1和E3泛素连接酶Parkin在线粒体质量控制中具有核心作用。当氧化应激、ROS积聚或药物摄入等原因导致线粒体膜电位受损时，PINK1会在线粒体外膜上稳定表达，招募Parkin、泛素化蛋白和自噬配体蛋白p62向受损线粒体聚集，促使线粒体自噬发生［26］。同样，在使用线粒体解偶联剂后亦能观察到PINK1选择性地积聚在去极化的线粒体上，促进PARK2移位至线粒体，从而促进线粒体自噬进程。此外，线粒体自噬还能通过PINK1-PRKN依赖性和非依赖性途径启动［27］。膜电位受损是肠缺血再灌注后常见的细胞损伤，及时清除膜电位异常的线粒体，增加正常线粒体比例，保持线粒体网络平衡，能够有效减轻肠缺血再灌注损伤。

2.6 BECN1 BECN1是Ⅲ类磷脂酰肌醇3激酶（Ptdlns3K）复合物的关键成分，是自噬体成核和欧米伽体形成所必需的。在饥饿诱导的自噬中，能够观察到Ptdlns3K复合体定位于MAM。PARK2能够被BECN1招募，重新定位于线粒体上，从而诱导线粒体外膜泛素化和蛋白酶体降解，抑制功能障碍的线粒体融合和运输。同时，PARK2在被BECN1重新定位后可以使线粒体通过特异性泛素结合受体蛋白与自噬体膜相关联，随后与自噬体膜融合，从而完成线粒体自噬过程［27］。BECN1是线粒体自噬过程中必不可少的蛋白质，在BECN1不存在的情况下，PARK2的招募和蛋白酶体介导的线粒体外膜蛋白降解无法有效进行［28］。BECN1是线粒体自噬的关键蛋白，可选择性清除功能障碍的线粒体，在肠缺血再灌注后细胞自我修复中起到关键作用。

3 MAM作为肠缺血再灌注损伤潜在的治疗靶点

目前，应对肠缺血再灌注损伤最有效的手段是及时恢复缺血部位肠道血供。再灌注虽然可以使肠道恢复血供，但血流再通后诱发的氧化应激、炎症反应、细胞凋亡、自噬以及线粒体动力学改变，会进一步加重包括肠道在内的多个器官功能损伤。线粒体Ca2+超载、氧化还原稳态失衡、蛋白质错误折叠会使线粒体膜通透性改变，线粒体功能障碍、mtDNA漏出，使缺血再灌注后肠道细胞ATP生成减少；mtDNA漏出可激活cGAS-STING通路，从而增强白细胞介素和肿瘤坏死因子转录，进一步加重细胞损伤，诱发全身炎症反应综合征和多器官功能障碍综合征。抑制MAM上的IP3R或VDAC可通过依赖AMPK的机制诱导自噬，清除受损的线粒体。IP3R-GRP75-VDAC和VAPB-PTPIP51能够直接影响线粒体内Ca2+含量，在肠缺血再灌注损伤前抑制VAPB-PTPIP51可降低肠缺血再灌注损伤后线粒体Ca2+超载的概率，减少Ca2+导致的线粒体自噬。调控Mfn的功能可以影响线粒体分裂和融合，控制细胞内线粒体的数量和质量，从而满足细胞的能量需求，清除功能障碍的线粒体，减少mtDNA渗漏，减轻肠缺血再灌注损伤后的炎症反应，降低全身炎症反应综合征和多器官功能障碍综合征的发生率。FUNDC1、PINK1和BECN1是负责线粒体自噬的关键蛋白，自噬不足和过度自噬均为组织损伤发生的重要因素，适当增加或抑制这些MAM上的关键蛋白可以调控线粒体自噬在一个适当的水平，起到肠缺血再灌注损伤后的脏器保护作用。

综上所述，MAM上的关键蛋白IP3R-GRP75-VDAC、VAPB-PTPIP51、Mfn、FUNDC1、PINK1、BECN1等，能够参与Ca2+信号传导、脂质转移、线粒体网络动态变化、线粒体自噬、线粒体膜孔道开放和内质网应激反应等。肠缺血再灌注后，肠道细胞内稳态被打破，Ca2+失衡、脂质氧化、线粒体网络失衡，自噬紊乱、线粒体膜孔道开放以及内质网应激反应发生等。MAM调控的线粒体事件与肠缺血再灌注后的病理生理变化高度重合。因此，通过调控MAM上蛋白表达变化，能够减轻细胞缺血、缺氧引起的氧化应激，增加细胞对线粒体功能的保护，从而减轻肠缺血再灌注损伤，降低患者死亡率。