DNA甲基化在神经发育及中枢神经系统相关疾病中的作用研究进展

于明懂，于泳浩，李佩，张英立

1天津医科大学第二医院，天津 300211；2天津医科大学总医院；3天津市天津医院

表观遗传学是指在不改变DNA序列的情况下，由环境因素的变化引起的基因功能的改变，表观遗传机制通过调控使相同基因在不同的细胞类型和背景下差异表达，以决定细胞命运，其表型的变化可以传递给后代细胞，而且这种变化是可逆的。表观遗传机制主要包括DNA甲基化、组蛋白翻译后修饰和核小体定位变化等，其中DNA甲基化作为一种重要的表观遗传学修饰方式已成为表观遗传学领域的研究热点，其对基因组的功能调控和稳定性维持具有重要意义［1］。在中枢神经系统，多种非遗传因素可以通过表观遗传学机制来影响突触的可塑性、记忆的获取和巩固、神经通路的连接以及神经信号的传递等，DNA甲基化在其中发挥了非常重要的作用。DNA甲基化在胚胎及神经系统发育、神经退行性病变和脑缺血性损伤等疾病的发展过程中都发挥着重要的作用，并已经成为疾病治疗过程中药物作用的靶点。本文旨在对DNA甲基化在神经发育及中枢神经系统相关疾病中的作用进展进行综述。

1 DNA甲基化及其在中枢神经系统中的功能概述

DNA甲基化是由一系列DNA甲基转移酶（DNMTs）催化的，它们将一个甲基从S-腺苷蛋氨酸（SAM）转移到胞嘧啶环的5号碳位上（5mC），通过改变局部染色质的结构来改变基因的表达。DNMTs主要有三种类型，其中DNMT3a和DNMT3b在发育或其他病理生理条件下，能催化双链DNA上未甲基化的基因位点出现新的甲基化，建立新的DNA甲基化模式；而DNMT1能识别半甲基化的DNA，在DNA复制过程中使现有的DNA甲基化模式得以维持。在哺乳动物中，DNA甲基化主要发生在胞嘧啶（C）-磷酸（p）-鸟嘌呤（G）二核苷酸（CpG）上，非CpG甲基化很少见，长度大于200 bp且C和G的含量大于50%的CpG聚集区称为CpG岛。DNA低甲基化发生在CpG岛以外的CpG位点，通常与基因激活有关；而DNA高甲基化，主要发生在CpG岛的基因启动子，通常与基因抑制有关。DNA甲基化通过直接抑制转录因子与启动子的结合以及招募DNA甲基结合蛋白来抑制基因表达［2］。

在中枢神经系统，DNMTl表达在有丝分裂后的神经元和神经胶质，主要作用是维持局部的甲基化状态；DNMT3a主要表达在发展、成熟的神经元，以及少突胶质细胞及星形胶质细胞中，对中枢神经系统的复杂行为学功能起到关键作用；DNMT3b则主要表达在胚胎及神经前体细胞，在成熟神经元内表达较少，但对突触可塑性和记忆形成有一定的调节作用［3］。通常，中枢神经系统内DNA甲基化水平处于动态并相对稳定的状态，在一些特定的生理情况或者病理状态下，DNA甲基化的状态能够被多种因素影响而发生改变，并造成一些神经功能的改变［2］。

2 DNA甲基化在胚胎发育及神经分化形成过程的作用

在哺乳动物的生命早期，来自父母的大多数DNA甲基化标记被清除，胚胎形成时全基因组DNA处于低甲基化水平，胚胎着床以后DNA甲基化水平迅速恢复并建立新的DNA甲基化模式，甲基化模式的建立依赖于DNMT3a和DNMT3b的催化，并且这些新的DNA甲基化模式在DNMT1的催化作用下保持相对稳定［4］。在胚胎神经母细胞中，通过基因敲除使DNMT1和DNMT3b失活会导致胚胎死亡，而DNMT3a失活的小鼠虽然出生时是健康的，但在出生大约4周时因神经发育缺陷而死亡，这说明DNMTs在胚胎发育的不同时期发挥不同的生理作用，胚胎内神经元的存活依赖DNMT1和DNMT3b，DNMT1在细胞分化和细胞分裂中起关键作用，DNMT3b在早期发育过程中必不可少，而DNMT3a能促进神经源性基因的转录，进而完成神经元的分化［2］。叶酸能为机体提供DNA甲基化所需要的甲基，孕期补充叶酸不仅可以降低新生儿神经管缺陷的发生率，而且可以提高后代的认知能力。一项研究表明，妊娠期母体叶酸缺乏造成子代个体发生了明显的DNA甲基化状态改变，子代雄性大鼠脑组织中有1 939个基因发生了差异甲基化，这些差异基因中很大一部分与神经发育和学习记忆能力相关［5］。

在人类的胎儿大脑发育过程中，DNA甲基化可以调控具有相同基因组的细胞产生不同类型、不同功能的神经元和胶质细胞群体。除了CpG甲基化，DNA的非CpG甲基化也在神经元的发育和成熟过程中发挥关键作用。最近的研究发现，在人类胎儿大脑发育过程中，基因组发生了高度动态的低甲基化和高甲基化，并观察到了几个显著的性别特异性基因的甲基化轨迹［6］。DNA甲基化可用于神经发育障碍的预测和诊断，由于早期它在诊断测试中的应用仅局限于少数基因位点，限制了它的应用，但伴随全基因组甲基化分析（GWMA）方法的使用，更多的基因位点的甲基化变化能够被准确地检测，DNA甲基化已经被用于诊断具有明确表观遗传特征的，不同基因相关的神经发育障碍［7］，这进一步说明了DNA甲基化在神经发育过程中的重要价值。

3 DNA甲基化在退行性疾病及认知功能障碍中的作用

DNA甲基化异常与许多神经退行性病变有关，其中发病率最高的是阿尔茨海默病（AD）和帕金森病（PD）。

3.1 AD AD是一种以神经原纤维缠结、淀粉样β蛋白（Aβ）斑块沉积和神经元丢失为特征的神经退行性疾病，表现为记忆和认知受损。AD是一种由遗传因素和环境因素相互作用引起的复杂疾病，具有相似或相同基因的个体在AD的发病率和临床表现方面的差异，提示表观遗传修饰在AD的发病过程中发挥一定的作用［8］。表观遗传机制在AD发病过程中的作用已经在细胞系、小鼠模型、死后脑组织和血细胞中得到了广泛的研究。AD患者大脑中DNMTs表达水平和DNA甲基化水平降低，提示DNA异常甲基化与AD的发病过程有密切的联系。研究发现，在AD患者的海马区，以及在功能或结构上与海马相连的区域（如内嗅觉皮质、颞叶皮质和额叶皮质），DNA甲基化水平均发生了显著的变化，DNA甲基化水平与海马区Aβ斑块和神经原纤维缠结负荷量负相关［9］。

AD的主要病因学假说是淀粉样变途径，多种因素可以通过调控与Aβ相关基因的DNA甲基化水平，通过这种途径来干扰Aβ的沉积或者清除，进而影响其发病。淀粉样前体蛋白（APP）、β-分泌酶1（BACE1）、早老素1（PSEN1）是Aβ产生过程中的重要参与者，脑啡肽酶（NEP）能催化裂解沉积的Aβ，分拣蛋白相关受体1（SORL1）能促进APP的循环和清除，抑制其在体内的表达。多项研究表明，AD患者大脑皮质或外周血中APP、BACE1、PSEN1、NEP、SORL1启动子甲基化水平都有显著的变化，APP、BACE1、PSEN1基因启动子区域DNA甲基化水平降低，APP外显子及SORL1启动子甲基化水平升高［10］。载脂蛋白E（APOE）蛋白在淀粉样蛋白沉积的形成过程中也起重要作用，APOE的ε4等位基因是晚发性AD最大的遗传风险因子，AD患者APOE-ε4的甲基化状态发生了明确的改变。近期的一项研究从AD患者脑内和外周血中提取DNA，使用甲基化阵列进行分析，根据组织类型、疾病状态、AD相关的生物标志物和基因表达，评估TOMM40-APOE-APOC2区域内甲基化的差异，结果表明DNA甲基化在与APOE相关的发病机制中发挥了作用，并将DNA甲基化作为调节AD患者APOE基因表达的潜在靶点［11］。

AD另一个病理特征为微管相关蛋白tau（MAPT）过度磷酸化导致的神经元缠结，AD患者tau蛋白基因启动子甲基化状态发生改变，导致转录因子结合启动子位点的能力改变，并进一步影响tau蛋白的生成和活性。AD患者tau蛋白基因上转录激活位点SP1和转录抑制位点GCF的甲基化水平随着年龄的增长显著降低，造成tau蛋白表达下调和转录活性整体下降，另外AD患者蛋白磷酸酶2A的低甲基化可导致tau蛋白异常磷酸化［12］。脑源性神经营养因子（BDNF）是突触可塑性和记忆形成的关键调节因子之一，AD患者BDNF启动子在海马等部位发生高甲基化，并伴随着这些区域BDNF的mRNA和蛋白表达降低，甲基化水平升高与病程呈正相关，而与记忆能力呈负相关［13］。

对DNA甲基化进行调节，可能会恢复年龄依赖性的认知减退，减缓AD的进展。外源性SAM以及营养和膳食化合物，例如叶酸和维生素B，会影响机体DNA甲基化水平，减轻许多与AD相关的危险因素和症状。有研究表明，补充叶酸可以显著改善AD患者的认知功能，血浆中维生素B12水平的升高可以降低痴呆认知障碍或同型半胱氨酸（Hcy）相关痴呆的风险，外源性补充SAM在对抗Aβ诱导的认知障碍，以及年龄相关损伤方面显示出良好的效果［12］，这些都提示DNA甲基化可作为AD的一个治疗靶点。

3.2 PD PD是老年人第二常见的神经退行性疾病，其特征是路易小体的形成、多巴胺能神经元（DAn）功能受损、运动功能下降和认知障碍。α-突触核蛋白（SNCA）在路易小体的形成中起重要作用，SNCA基因的甲基化水平与SNCA表达之间存在密切联系，SNCA基因的内含子1（SNCAi1）是一个转录活性区域，SNCA发挥作用与SNCAi1的甲基化状态有关［14］。在PD患者的脑组织和血液中，SNCA的CpG岛是低甲基化的，在接受较高剂量左旋多巴的PD患者中发现，其SNCA甲基化水平增加，提示左旋多巴可能是通过DNA甲基化对PD患者发挥作用［15］。多巴胺转运蛋白（DAT）在多巴胺神经传递过程中发挥重要作用，适当调控DAT的表达对维持多巴胺系统内稳态至关重要。DAT1基因是人类DAT的编码基因，在PD患者的外周血单核细胞中发现，DAT1基因上的特异性CpG位点5′-UTR的甲基化水平显著升高，这提示DAT1基因的甲基化可能参与了PD进展的过程，然而DAT1基因的甲基化水平能否作为PD生物标志物，特别是其甲基化水平是否与疾病的严重程度相关，还需要在更大样本的实验中做进一步的研究［16］。

MAPT基因是特发性PD的易感基因，相关研究发现，PD患者异常的MAPT甲基化与发病年龄和疾病状态有关，MAPT基因启动子区表现为高甲基化状态，这种高甲基化状态能降低tau蛋白的表达，从而起到一定的神经保护作用；研究还发现PD患者的MAPT基因甲基化与性别相关，女性白细胞中MAPT基因甲基化水平明显高于男性，这可能是女性患PD的风险比男性低的原因之一［17］。PD的发生与炎症反应密切相关。肿瘤坏死因子α（TNF-α）是一种关键的炎症细胞因子，TNF-α的增加与PD中的DAn死亡有关。研究表明在大脑皮层、纹状体和黑质中，TNF-α基因启动子中特定CpG岛的甲基化水平升高，导致转录因子AP-2和SP1的结合减少，并抑制TNF-α启动子的活性，进而影响TNF-α的表达［18］。

MASLIAH等［19］最早提出PD患者的外周血DNA甲基化模式有望作为PD的生物标志物。近期的一项纵向全基因组甲基化研究，对189例具有典型临床表现特征的PD患者和191例对照组进行了调查，在疾病初期和随访2年之后，共获得约85万个CpG位点的甲基化数据，结果显示PD患者表现出了不同的甲基化模式，PD患者中DNA甲基化是动态的，并随着疾病进展而改变；常见的PD治疗药物包括左旋多巴制剂和COMT抑制剂，它们都会影响血液中的DNA甲基化模式，说明血液中的DNA甲基化模式可以作为PD患者疾病发展过程中的生物标志物［20］。这为PD的诊断和治疗提供了新的思路。

4 DNA甲基化在脑卒中发展过程中的作用

脑卒中是一类可造成脑缺血缺氧损伤的疾病，包括缺血性脑卒中和出血性脑卒中。受多种遗传和环境因素影响，脑卒中是导致成年人残疾的主要原因，也是全球人口第二大死亡原因，发病率逐年增高，引起全世界范围内的关注。然而，其潜在的发病机制尚不完全清楚，表观遗传学相关研究的不断发展可能会为这一领域提供新的见解，有助于进一步理解其病理机制［21］。最早的一项研究显示，缺血缺氧性脑损伤导致脑内甲基含量增加了3～4倍，表明DNA甲基化在脑缺氧缺血性损伤的发展过程中起重要作用，之后进行了大量的动物实验和临床研究，证明DNA甲基化在脑卒中的发病、治疗、复发和功能预后等发展过程中发挥着重要的作用［22］。一般来说，脑卒中时DNA甲基化的整体水平较高，并且与大脑中较高的DNMTs活性有关。

Hcy升高是脑卒中确定的危险因素之一，DNA甲基化在血浆Hcy水平升高过程中发挥重要作用。胱硫醚-β-合成酶（CBS）是Hcy转化为半胱氨酸的主要催化酶，其缺乏可导致高Hcy血症。在脑卒中患者中，CBS启动子区甲基化水平升高，这使CBS基因表达水平降低，导致血浆Hcy积聚，增加了脑卒中风险［23］。四氢叶酸还原酶是Hcy降解过程需要的一种酶，其生成由MTHFR基因编码，脑卒中时MTHFR基因的甲基化水平降低，四氢叶酸还原酶生成减少，导致Hcy水平升高，而MTHFR基因的高甲基化是脑卒中的保护因素，这种保护作用在男性中更加显著，这些表明MTHFR启动子甲基化状态可能在脑卒中中具有诊断价值［24］。脑卒中患者血浆Hcy水平升高也与血栓调节蛋白（TM）基因的DNA高甲基化有关，TM基因作为凝血酶的辅助因子，能降低凝血酶活性，其DNA甲基化升高能抑制TM表达，促进脑卒中的发生［25］。

HLA-DRB1和HLA-DQB1基因与脑卒中的早期神经恶化有关，它们具有调节动脉粥样硬化斑块中细胞增殖的功能，这些基因在脑卒中患者中表现为高甲基化，并伴随基因表达下调，导致动脉中的炎症反应和动脉斑块的形成，从而导致了脑卒中病理过程 的 开 始［26］。长 链 非 编 码RNA GAS5（lncRNA GAS5）可调节血管内皮细胞的凋亡，lncRNA GAS5能与丝裂原活化蛋白激酶4（MAP4K4）的启动子发生相互作用，研究表明，通过抑制MAP4K4启动子的甲基化，使lncRNA GAS5表达沉默，减少了脑卒中时神经元的凋亡并改善了神经功能［27］。DNA甲基化在脑卒中后疾病复发的过程中也发挥作用，一项对接受抗血小板药物治疗患者的研究表明，肿瘤坏死因子受体相关因子3和蛋白磷酸酶1A的低甲基化升高了中风患者的复发风险［28］。

DNA甲基化干预药物可用于脑卒中的治疗。脑缺血损伤后，脑组织内总体DNA甲基化水平增加，并且与脑损伤的严重程度密切相关。在大脑中动脉阻塞大鼠模型中，DNMTs的药理抑制剂被证明可以降低DNA甲基化水平，缩小梗死范围，减轻脑缺血损伤［29］。神经元网络重组是脑损伤后维持神经元功能的主要机制，通过应用DNMTs的抑制剂——5-氮杂-2′-脱氧胞苷进行治疗，以降低DNA甲基化水平，可显著增加脑卒中后健侧的红核、延髓网状结构和脊髓背外侧的交叉纤维数目，并升高健侧皮质脑源性神经营养因子的表达水平，从更大程度上促进运动恢复［30］。

研究证明，氨基末端脑钠肽前体（proBNP）是缺血性卒中短期和长期组织损伤的有效生物标志物，血液中较高水平的proBNP可以预测卒中后1年的长期功能不良结局，BNP编码基因（NPPB）参与了proBNP在脑卒中时发挥作用的过程，NPPB基因的甲基化水平降低使proBNP的生成增加，NPPB基因启动子的甲基化水平与脑卒中功能预后显著相关［31］。根据全血DNA甲基化水平计算出的表观遗传年龄在脑卒中患者中比健康人大2.5岁，研究结果表明，与实际年龄相比，表观遗传年龄可以更好地预测患者卒中3个月后的功能恢复情况，这提示表观遗传年龄可以作为脑卒中后独立的危险因素，能更好地预测脑卒中的预后情况［22，32］。

5 DNA甲基化在中枢神经系统相关疾病中的应用前景

在人类神经发育及中枢神经系统相关疾病发展过程中，想要获得更准确的生物学资料往往需要直接获取组织标本，由于难以从活体受试者获得大脑样本，所以通常研究样本规模较小，限制了相关研究的发展。DNA甲基化在外周血，甚至唾液中都表现出了与大脑的DNA甲基化模式很好的相似性［33-34］，这使得DNA甲基化有望在神经系统相关疾病的预防和诊断过程中能够发挥更大的作用。另外，由于DNA甲基化是一个可逆的过程，能够被药物调控，使其能够成为神经系统相关疾病治疗过程中的药物靶点，新型的DNA甲基化调节药物正在逐步问世，有望对相关疾病的治疗提供重要的帮助，具有重要的临床意义。虽然对DNA甲基化的全面研究可能需要更精确的解析，但相信随着DNA甲基化检测技术的发展，这一目标最终会得到实现。