环状RNA在急性心肌梗死心脏损伤与修复中作用的研究进展

曾晓辉，卢帅，汪朝晖

华中科技大学同济医学院附属协和医院，武汉430022

急性心肌梗死（AMI）是一种严重威胁人类生命健康的缺血性心脏病，尽管近十年在AMI 的预防及救治上获得了进步，但其发病率及病死率仍较高，全球每年有超过700 万人受其影响［1］。目前 AMI 的发生主要是由于动脉粥样硬化斑块破裂并形成血栓，导致冠状动脉急性、持续性堵塞，引起心肌细胞缺血坏死。AMI 发生后会引发心肌细胞坏死凋亡、梗死部位炎症形成、心肌纤维化等一系列病理改变，严重降低患者心功能，同时伴随心肌细胞再生、新生血管形成等代偿修复过程。因此减少心肌细胞坏死凋亡、抑制心脏炎症及心肌纤维化、促进心脏自我修复是治疗AMI 的关键。环状RNA（circRNA）是一种具有共价闭环结构的新型非编码RNA，由于特殊的合成方式导致其不含5'末端帽子结构和3'多聚腺苷酸尾结构，因此circRNA 不易被核酸外切酶分解，在各类组织细胞中表达更加稳定［2］。近年来随着基因芯片、二代测序以及生物信息学的快速发展，使得包括circRNA 在内的一系列非编码RNA 成为了研究热点。大量研究证实，circRNA 可在生物体内发挥重要生物学功能，在某些疾病（AMI、心力衰竭、心律失常等）的发生发展中起关键作用［3］。circRNA 可作为心血管疾病的潜在生物标志物和治疗靶点。本文对circRNA 的生物学功能及其在AMI 心肌损伤、修复中的作用进行综述。

1 circRNA概述

1.1 circRNA 的生物学特性 于20 世纪70 年代，circRNA 在植物感染的类病毒中被发现，被认为是由于反向剪接而产生［4］。1993 年，在哺乳动物中偶然发现了 circRNA 的大量存在［5］。2012 年，随着RNA 测序技术和生物信息学的逐渐成熟，真核生物中circRNA 的丰度和普遍性才得到认可。circRNA的合成机制目前尚未完全阐明，通过反向剪接将下游的5'剪接位点与上游的3'剪接位点通过共价键连接形成外显子环状RNA［6］。由于其特殊的合成方式和生物学结构，circRNA 主要具有以下生物学特性：①circRNA 广泛表达于人类细胞中，其表达量是mRNA 的 10 倍以上［6］。②由于 circRNA 的闭环结构，导致其被核酸酶降解的较少，比线性RNA 更稳定。③绝大多数circRNA 序列在物种之间具有高度保守性［6-7］。④绝大多数 circRNA 位于细胞质中，只有小部分位于细胞核［8］。⑤其主要来自外显子，其他一小部分来自内含子或内含子片段。⑥其表达通常具有细胞、组织以及发育阶段特异性。

1.2 circRNA的主要生物学功能

1.2.1 充当微小RNA（miRNA）的分子海绵 miR⁃NA 可与mRNA 的3'非翻译区结合，进而抑制该mRNA 的翻译。circRNA 的分子海绵作用是指其可作为竞争性内源性RNA 与miRNA 的结合位点互相结合，抑制miRNA 的生物活性，从而间接调控下游靶分子的表达。circRNA ciRS-7 是首个被发现能作为 miRNA 分子海绵的环状 RNA［9］，其与 miR-7 具有70多个结合位点，能够有效降低miR-7的生物活性，增强其下游靶基因的表达。ZHENG 等［10］发现，circHIPK3可通过充当miR-124和miR-193的分子海绵对癌细胞发挥生长调节作用。

1.2.2 参与RNA 转录的调节 尽管绝大多数circRNA 位于细胞质中，但也有少部分位于细胞核，参与 RNA 转录的调节。ZHANG 等［11］研究发现，环状内含子RNA 在细胞核中表达丰富，可在核内通过与磷酸化的RNA 聚合酶Ⅱ相互结合，使其转录活性发生改变，从而发挥转录调控作用。另有研究发现，外显子-内含子环状RNA 是一种保留内含子的circRNA，定位于其亲本基因的启动子附近，并可与RNA 聚合酶Ⅱ结合，通过与保留在内含子中的5'剪接位点相互作用来提高转录效率，从而促进其亲本基因的表达［12］。

1.2.3 调节mRNA 的稳定性 部分circRNA 还可调节 mRNA 的稳定性。HANSEN 等［13］研究发现，来源于小脑变性相关蛋白1（CDR1）基因的环状反义RNA 可与CDR1 的mRNA 形成双链结构，增强其稳定性。另有研究表明，小鼠巨噬细胞中的circ-Ras⁃GEF1B 可增强细胞间黏附分子 1（ICAM-1）mRNA 的稳定性，从而使LPS/TLR4 炎症信号通路中ICAM-1的表达增加［14］。

1.2.4 通过与蛋白质相互作用发挥功能 circRNA可通过与蛋白质结合从而对RNA 结合蛋白（RBP）发挥招募、转运以及蛋白支架的作用，调节RBP 生物活性。DU 等［15］研究表明，在小鼠成纤维细胞中，环状RNA circFoxo3 可与细胞周期蛋白依赖性激酶2（CDK2）和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1（P21）结合，这种circFOXO3-p21-CDK2 三元复合物的形成会抑制CDK2功能，从而阻止细胞周期进程。

1.2.5 具有蛋白翻译功能 以往有观点认为，circRNA 作为一种非编码RNA 无法翻译成蛋白质，但近年来研究发现，circRNA 也具备蛋白翻译功能。第一个被科学家发现具有蛋白翻译功能的circRNA是一种存在于丙型肝炎病毒中的单链环状RNA，可产生一种具有122 个氨基酸的蛋白质［16］。YANG等［17］鉴定了人成纤维细胞中circRNA 所翻译的几种多肽，并且发现当腺苷被甲基化修饰时，起始密码子上游的6-甲基腺嘌呤修饰的共有基序促进circRNA的翻译能力。另有研究证明，circZNF609 可在小鼠以及人成肌细胞中与多聚核糖体相互作用，以剪接依赖性和帽依赖性的方式进行蛋白翻译［18］。虽然circRNA 已被认为具有一定的翻译能力，但是目前发现由于受其特殊的环状结构影响导致翻译效率不高，且circRNA 的翻译产物（蛋白质及多肽）的功能尚不明确，有待于学者进一步探究。

2 circRNA在AMI心脏损伤与修复中的作用

2.1 circRNA 在 AMI中的表达谱 LIN 等［19］利用芯片技术检测了AMI 患者和正常人外周血中circRNA的表达，共得到266个差异表达的circRNA，其中121个表达上调、145 个表达下调。WU 等［20］利用基因芯片进行了AMI 小鼠中circRNA 的表达谱分析，circRNA 芯片中共检测到1 163个circRNA，其中差异表达的 circRNA 有 63 个，其中 29 个表达上调、34 个表达下调；从表达上调和下调的circRNA 中各选择了6 个在心肌组织样本中进行验证，发现实时荧光定量聚合酶链式反应结果和芯片结果一致。用Tar⁃getScan 等在线数据库分别预测了与mmu_circRNA_013216 和 mmu_circRNA_010567 相关的 miRNA，结果发现与mmu_circRNA_013216 相互作用的miRNA有 miR-181a-3p、miR-486a-5p 和 miR-486b-5p；与mmu_circRNA_010567相关性较大的miRNA 有miR-124、miR-141 和miR-200a。以上研究表明差异表达的circRNA可能在AMI的发生发展中起一定作用。

2.2 circRNA 在AMI 心肌细胞凋亡中的作用 心肌细胞凋亡在AMI 心肌损伤中起重要作用，其凋亡的严重程度直接影响患者的心功能及预后，是AMI的重要病理特征。WANG 等［21］研究发现，circRNA MFACR 在心肌缺血损伤后的细胞凋亡中具有重要作用；circRNA MFACR 可充当 miR-652-3p 的分子海绵抑制其活性，miR-652-3p 活性被抑制后有利于其下游靶分子线粒体三功能蛋白18（MTP18）表达上调。MTP18 能够促进细胞线粒体裂变和心肌梗死小鼠心肌细胞凋亡。由此可知，circRNA MFACR 可通过MFACR/miR-652-3p/MTP18 信号轴来促进缺氧心肌细胞线粒体分裂和细胞凋亡。CAI 等［22］在AMI大鼠心肌中发现circ-Ttc3 表达显著上调，利用重组腺相关病毒在大鼠体内干扰circ-Ttc3 的表达后发现，心肌梗死大鼠的心功能障碍加重，同时TUNEL实验发现circ-Ttc3 沉默后也加剧了心肌细胞的凋亡；而circ-Ttc3 表达上调能够抑制聚腺苷二磷酸核糖聚合酶和半胱氨酸蛋白酶3 的表达，继而抑制心肌细胞凋亡。随后通过线数据库预测以及荧光素酶实验发现，circ-Ttc3可作为miR-15b的竞争性内源性RNA，通过上调其下游靶基因ADP-核糖基化样因子2（Arl2）的表达来发挥心脏保护作用。Arl2 是一种小型三磷酸鸟苷结合蛋白，可参与氧化磷酸化和ATP 的产生。提示circ-Ttc3 也可通过调节ATP 的生成从而减轻心肌细胞凋亡。另有研究发现，AMI 心肌组织及体外缺氧诱导的心肌细胞中circ_0068655表达上调，上调的circ_0068655 能抑制细胞活力并促进心肌细胞的凋亡，提示circ_0068655 在AMI 心肌细胞凋亡中发挥了重要作用［23］。

2.3 circRNA 在梗死后心肌纤维化中的作用 心肌纤维化是一种由于心肌成纤维细胞过度激活进而引起细胞外大量纤维蛋白沉积的常见心脏病理改变，是AMI 心室重构的主要表现之一，可导致AMI患者心肌收缩和舒张功能障碍。心肌纤维化的形成机制复杂，目前关于AMI 心肌纤维化的机制尚未完全阐明。研究发现，circ_LAS1L 能够抑制AMI 后心脏成纤维细胞的活化、增殖和迁移，并促进细胞凋亡［24］；circ_LAS1L 可与 miR-125b 结合并抑制其活性，从而促进其下游靶基因分泌型卷曲相关蛋白5（SFRP5）的表达，继而减少α 平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、胶原纤维Ⅰ和胶原纤维Ⅲ的生成。表明circ_LAS1L 可 通 过 circ_LAS1L/miR-125b/SFRP5 轴来调节心脏成纤维细胞的生物学功能。BAI 等［25］研究发现，circRNA 010567 对AMI 大鼠心肌纤维化具有调节作用；利用小干扰RNA 干扰大鼠AMI模型中circRNA 010567 的表达后发现，心肌梗死大鼠的心功能明显改善，心肌纤维化减轻。干扰组大鼠心脏组织中的转化生长因子β1（TGF-β1）表达也随之下降，提示将circRNA 010567 沉默后可能通过抑制TGF-β1信号通路来减轻AMI 心肌纤维化。另有研究发现，AMI 小鼠中circNFIB 表达降低，将circNFIB过表达后可通过调控miR-433 来抑制心脏成纤维细胞的增殖，继而减轻心肌纤维化。

2.4 circRNA 在 AMI 心脏修复中的作用 AMI 发生后机体会启动代偿修复机制，对心脏结构和功能丧失进行一定程度的补救。其中，心肌细胞增殖和新生血管形成是AMI 心脏修复的两个主要生物学过程，两者之间的协同作用对心脏再生修复必不可少。SI 等［26］研究发现，circHipk3 在胎儿和新生儿心脏中高表达；circHipk3 过表达可改善AMI 小鼠的心功能，同时促进了梗死区心肌细胞增殖，并使得毛细血管密度增加，而心肌细胞凋亡和纤维化则有所减轻；进一步研究circHipk3 诱导心肌细胞增殖的机制，通过RNA 下拉实验以及蛋白质谱分析发现circHipk3 可与Notch1 胞内结构域（N1ICD）结合，敲低circHipk3 的表达后可降低N1ICD 蛋白表达，表明circHipk3 对心肌细胞增殖的作用可能通过调节N1ICD稳定性来实现。同时，WANG等［27］研究发现，缺氧诱导的心肌细胞所分泌的外泌体环状RNA circHIPK3 能够调节AMI 后的心脏血管生成；circH⁃IPK3 可抑制 miR-29a 活性，而 miR-29a 可通过靶向血管内皮生长因子A（VEGFA）来抑制心脏内皮细胞的增殖、迁移。因此circHIPK3 可通过miR-29a/VEGFA 信号轴来促进心肌内皮细胞的增殖、迁移和血管形成；同时体内实验发现外泌体中的circHIPK3能够使AMI 小鼠心脏梗死区的血管密度增加，促进新生血管形成并改善了心肌纤维化。

circRNA 还可通过与蛋白质直接结合来完成其对AMI 后心脏结构和功能的修复。GARIKIPATI等［28］在AMI 小鼠心脏以及缺血性心肌病患者的心脏组织中发现circFndc3b 表达降低，在AMI 小鼠中将circFndc3b 过表达可改善小鼠左心室收缩功能；同时还发现circFndc3b 过表达使得AMI 小鼠心脏毛细血管密度和α-SMA 阳性小动脉增加，心肌纤维化减轻。该作用可通过FUS/VEGF-A 信号轴介导。以上研究为探索AMI 心脏修复治疗提供了新的研究思路。

2.5 circRNA 可作为AMI 潜在的生物标志物 当AMI 发生后，由于心肌组织的损伤导致更多的心肌肌钙蛋白（cTn）和肌酸激酶（CK）释放到外周血中，使得血液中的cTn 和CK 含量增加，因此临床上cTn和CK 可作为AMI 的诊断标志物。然而，心肌炎、肺动脉栓塞等其他疾病以及正常人剧烈运动后也可有cTn 和 CK 的异常释放［29］，因此二者特异度不高，且稳定性较低。研究证实，circRNA 具有稳定性高、表达丰富、种类多样等特点，可作为心血管疾病、癌症以及免疫紊乱等疾病的生物标志物［30］。circRNA MICRA 是一种主要存在于外周血细胞中的与心肌梗死相关的 circRNA。VAUSORT 等［31］发现，与健康对照组相比，AMI 患者外周血细胞中circRNA MI⁃CRA 的表达低，MICRA 是左室功能障碍的预测指标。SALGADO-SOMOZA 等［32］研究也发现，左室射血分数明显降低的AMI 患者外周血细胞中circRNA MICRA 的表达低于射血分数保留或射血分数轻微降低的患者。表明circRNA MICRA 有可能成为评估AMI 患者预后的生物标志物，但目前有关circRNA作为AMI生物标志物的研究较少。

综上所述，circRNA 具有多样化的生物学功能，并在AMI 心脏损伤修复中具有重要作用。虽然目前对circRNA有了一定了解，但对circRNA的研究仍处于起步阶段。对circRNA 是否具有其他生物学功能、以何种方式分解、在AMI 中是否参与了梗死后心肌炎症的形成、何时可在临床上作为AMI 的诊断标志物等一系列问题仍知之甚少。随着芯片技术及生物信息学的发展，相信circRNA 在AMI心肌损伤、修复中的作用将被深入研究，为AMI 的诊断和治疗提供新的理论依据。