番茄红素摄入与围产期奶牛氧化应激和炎症的关系

马燕芬 宝 华 张春华 宋利文 凤 英 羿 静 高 民

（内蒙古自治区农牧业科学院，动物营养与饲料研究所，内蒙古呼和浩特010031）

围产期是奶牛代谢性疾病和感染性疾病的高发阶段，严重影响奶牛代谢状况、机体健康、繁殖性能和生产性能。奶牛大约75%的疾病主要发生在泌乳启动后的第一个月，泌乳早期出现的健康问题会持续很长时间，给奶牛业产生巨大的经济损失[1-2]。目前已确定出围产期奶牛健康失调与氧化还原失衡和免疫失衡有关[3-5]，也已确定出机体健康紊乱与炎症反应增加密切相关[6]。具体来讲，奶牛在泌乳启动后由于采食量低下和机体代谢需求增加，导致活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成增加。ROS 是线粒体能量代谢过程中产生的代谢产物，过氧化氢（hydrogen peroxide，H2O2）作为过氧化物酶体也参与了ROS 的生成，并被引入到线粒体代谢过程中发挥氧化作用[7]。当超过机体耐受的ROS 不能被宿主抗氧化防御系统中和时，就会产生氧化应激[8]，而长时间的氧化应激是导致机体功能失调性炎症反应的重要潜在因素，如乳房炎[3，9]。越来越多的研究表明，氧化应激主要是通过激活炎症信号通路进而增加促炎细胞因子如肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α, TNF-α）、白细胞介素-1β/6（interleukin-1β/6，IL-1β/6）的表达[10]，并最终导致奶牛乳腺产生炎症反应和疾病[11-13]。因此，抑制氧化应激对预防炎症反应和慢性疾病至关重要。目前在奶牛养殖过程中做到泌乳早期预防炎症疾病发病的少之又少，大部分奶牛场是在奶牛发病后直接使用抗生素疗法进行干预，而抗生素疗法给奶牛业带来的潜在危害是不可估量的。2020年7月1日我国已全面进入养殖端禁抗阶段[14]，禁止在饲料中使用药物饲料添加剂，而植物提取物类则仍可在饲料中使用。基于以上分析，尤其对于高产奶牛，围产期日粮中添加植物源性抗氧化剂是清除体内多余自由基，降低机体氧化应激的有效途径；也是降低由氧化应激导致组织、器官和细胞产生炎症反应和机体损伤的有效途径，且植物源性抗氧化剂具有成本低廉、来源广泛等特点。番茄红素是主要存在于西红柿、木瓜、杏、粉红葡萄柚、粉红番石榴、西瓜等红色水果和蔬菜中的一种天然类胡萝卜素和类胡萝卜素色素，具有抗氧化和抗炎症作用[15]。本文将概述番茄红素如何调节与围产期奶牛疾病易感性相关的氧化应激和炎症反应，以期推动番茄红素及其制品在奶牛生产中的应用。

1 氧化应激与炎症反应

奶牛在分娩后因能量需求超过能量摄入而使奶牛产生能量负平衡（Negative energy balance，NEB），长时间的NEB会导致奶牛产生代谢应激，并动员脂质进而产生ROS。当机体内氧化剂产生和抗氧化防御系统之间不平衡时，就会产生氧化应激，这种不平衡会改变细胞膜和细胞器，导致脂质和小分子氧化。当这种不平衡持续存在时，有机体的新陈代谢就会受到阻碍，这将会导致细胞损伤和/或功能障碍[16]，从而导致各种慢性疾病。早期研究认为氧化应激是奶牛疾病发病的原因[17]，现如今研究发现，氧化应激更多影响的是宿主的免疫系统和炎性应答，且体内体外研究证实围产期奶牛氧化应激可能是炎症应答系统和免疫系统紊乱的主要原因[18]，进而增加围产期奶牛对疾病的易感性。因此，氧化应激被认为是连接奶牛代谢系统和免疫系统的纽带。

1.1 氧化剂与炎症反应

氧化剂包括介导敏感大分子氧化的自由基和非自由基分子，主要是ROS和活性氮（reactive nitrogen species，RNS），ROS和RNS是机体正常的代谢产物，又被称为活性代谢物。ROS和RNS对信号传导功能至关重要，而信号传导功能又是细胞增殖、分化和代谢适应过程所必需的。如线粒体通过Krebs'循环和电子传递链产生三磷酸腺苷（ATP）时伴随着超氧化物（O2-）和H2O2的产生，线粒体氧化磷酸化反应过程中，大约1%～3%的电子被转移到O2中形成O2-[19]，生成的O2-被超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）催化直接转化为H2O2。O2-和H2O2通过氧化含巯基的半胱氨酸残基，参与信号网络中各种蛋白质如丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）的磷酸化[6]，MAPK信号通路是一个重要的炎症信号通路。活性代谢物ROS 可激活MAPK 炎性通路[20]，进而激活炎症信号通路核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB），诱导NF-κB磷酸化和降解，并释放p65 NF-κB进入细胞核激活NF-κB 通路，诱导多种炎症因子（如TNF-α、IL-1β/2/6/18）的表达，介导机体炎症反应[21]。

机体代谢需求增加（如奶牛妊娠期间）时，活性代谢物产量就会增加[22]；机体炎症反应增加（如奶牛疾病状态）时，活性代谢物产量也会增加，并会增加到先天性免疫功能和适应性免疫功能所需水平[3]。机体内源性细胞是将活性代谢物的积累限制在机体生理限度内，以防止细胞产生损伤；与内源性细胞生理作用相反，炎症反应则是使机体内活性代谢物水平升高，并远远高于机体生理限度，如发生在急性大肠杆菌型乳房炎期间的脂质氧化，将会加重乳房炎发病程度，尤其是在奶牛泌乳早期[6，23]。因此，早期疏于预防，机体内产生的多余的活性代谢物将会加重炎症性疾病的发病程度和发病长度。

1.2 抗氧化防御系统

抗氧化防御系统可以中和、代谢和延迟氧化剂的产生。抗氧化剂包括内源性酶，如SOD、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidases，GPx）、硫氧还蛋白还原酶（thioredoxin reductases，Trx）、过氧化物酶（peroxiredoxins）、催化酶（catalases，CAT）、血红素加氧酶（heme oxygenase，HMOX-1）和醌氧化还原酶1[NAD(P)H：quinone oxidoreductase 1，NQO1]。日粮则是抗氧化剂来源的非酶库，包括微量矿物元素（硒、铜、锌）、多酚、维生素（vitamin A、C、D和E）、β-胡萝卜素和番茄红素[24]。酶和非酶抗氧化剂协同作用是有效防止活性代谢物损伤细胞的有效措施[3]。早期研究发现，将奶牛乳腺上皮细胞（bovine mammary epithelial cells，BMECs）和主动脉内皮细胞暴露于氧化剂中，就会增加活性代谢物的产生，损伤细胞并诱导细胞凋亡，补充非酶抗氧化剂硒[25-26]和植物多酚[20,27]则可激活内源性酶抗氧化剂而得到改善。此外，氧化剂O2-可在SOD 依赖于微量矿物质铜和锰的歧化作用下生成H2O2，H2O2在GPx 或硒依赖性GPx 和Trx 还原酶作用下还原为H2O 和O2，同时，还原型谷胱甘肽（Glutathione，GSH）被氧化为氧化型谷胱甘肽（GSSG），GSSG在GSH 还原酶的催化下又生成GSH。GSH 是一种抗氧化剂，可保护蛋白质分子中巯基免遭氧化，保护巯基蛋白和酶的活性。GSH还可用于GPx或Trx介导的新陈代谢[3]。因此，GSH和GSSG之间的平衡是至关重要的，因为GSH与GSSG的失衡可以改变细胞氧化还原平衡，导致氧化应激。还原型GSH能清除机体内预先形成的活性代谢物，并参与再生和维持其他抗氧化酶如维生素的功能。例如，细胞膜中脂质自由基中和过程中形成的氧化维生素E自由基被过氧化物酶利用GSH作为辅因子循环回还原维生素E。维生素E和硒等日粮微量营养素被认为是在机体代谢需求增加期间增强抗氧化防御机制和减少奶牛健康紊乱的重要工具[3,28]。

1.3 抗氧化应答基因通路与炎症反应

抗氧化应答基因通路的激活是限制机体过度活性代谢物积累的另一个重要机制。核因子-E2 相关因子2（Nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，NFE2L2）是一种重要的氧化还原敏感性转录因子，通过激活抗氧化酶和下游Ⅱ相解毒酶发挥抗氧化作用[29-30]。生理状态下，NFE2L2与Kelch-Like-ECH Associated Protein 1（KEAP-1）结合处于静态；在氧化应激时或NFE2L2激动剂存在下，NFE2L2与KEAP-1解离并易位进入细胞核，NFE2L2 激活抗氧化基因启动子区的抗氧化应答元件（antioxidant response elements，ARE），进而激活下游抗氧化酶如SOD、GPx、Trx、CAT、GSH 和Ⅱ相解毒酶如HMOX-1 和NQO1 而发挥抗氧化作用[31]。李慧等[32]详细阐述了NFE2L2 是如何调控抗氧化因子如HMOX-1、NQO1、SOD、CAT和GSH，这里不再赘述。氧化应激状态下，ROS 激活MAPK 炎性通路参与调节NFE2L2 的磷酸化，ROS 主要是通过直接磷酸化NFE2L2或磷酸化中间激酶促进NFE2L2进入细胞核调节抗氧化目标基因及下游基因的表达[33]。NFE2L2对炎性反应也有非常重要的调控作用，如敲除NFE2L2后，奶牛乳腺上皮细胞[10]和脑组织[34]的氧化应激反应和炎症反应会进一步增强，严重损伤神经系统功能；反之，增强NFE2L2 活性，可减轻氧化应激和炎症反应，加快神经功能的恢复。因此，在氧化应激易发期，如奶牛围产期间、患有乳房炎和子宫内膜炎在内的疾病期间，可通过调控NFE2L2 通路达到调控奶牛机体抗氧化和抗炎作用。此外，酶和非酶组分也可对整体细胞抗氧化功能共同起作用，这对于在炎症性疾病期间抵抗细胞产生氧化损伤至关重要。

2 番茄红素

近几十年来，包括番茄红素、β-胡萝卜素、叶黄素、玉米黄质和β-隐黄质等在内的类胡萝卜素由于其抗氧化和抗炎作用在人类营养领域引起了极大的关注，类胡萝卜素作为生物活性化合物被认为在预防人类疾病和保持良好健康方面发挥着重要作用，可以潜在地保护人类免受免疫应答、早衰、癌症、心血管疾病和关节炎等疾病的影响。类胡萝卜素是自然界中分布最广、最普遍的脂溶性天然色素之一，存在于水果和蔬菜等植物的叶子、花、根和种子中，还存在于藻类、真菌、鸟类、甲壳类动物或昆虫肉角质层中。与果肉相比，植物果皮渣中的类胡萝卜素含量通常更高。它们不能被人或动物机体合成，只能通过饮食/日粮摄入补充。番茄红素是最为常见的类胡萝卜素之一。

2.1 番茄红素的特性

番茄含有不同种类的具有抗氧化特性的化合物，如类胡萝卜素、抗坏血酸、酚类化合物和α-生育酚。由于食用量高，番茄及其制品是人类饮食中类胡萝卜素的主要来源。番茄红素是一种天然胡萝卜素和类胡萝卜素色素，大量存在于如番茄、木瓜、杏子、粉色葡萄柚、粉色番石榴和西瓜等红色水果和蔬菜中[15]。番茄红素有11 个线性共轭双键和两个非共轭双键，占完全成熟果实中番茄类胡萝卜素总含量的80%以上。在所有类胡萝卜素中，番茄红素因其共轭双键的长度，是一种强有力的单线态氧物理淬灭剂，其物理淬灭率是β-胡萝卜素的2倍，α-生育酚的10倍[35]。番茄红素通过缓解氧化应激、抑制炎症细胞因子产生、减轻淀粉样变性或淀粉样斑块的积累而表现出机体保护作用[36-37]，番茄红素还可通过改善肠-肝-脑轴炎症、改善糖脂代谢失衡、抑制凋亡和恢复线粒体功能而减轻机体缺陷[38]。

2.2 番茄红素的抗氧化作用

目前有关番茄红素在反刍动物上的研究报道逐年增加。奶畜在产仔后，因采食量低下和机体代谢强度增加导致乳腺组织产生过量的ROS诱发氧化应激，长时间的氧化应激又会诱发乳腺上皮细胞产生炎症反应和凋亡[39]。氧化应激是由活性氧的形成和抗氧化防御的减少之间的不平衡引起的，这种不平衡通过细胞脂质、蛋白质和DNA 的氧化导致机体组织的实质性损伤[22，41]。因此，维持细胞内氧化还原平衡以降低氧化应激相关疾病的风险对围产期奶畜来说是非常重要的，而提高奶畜乳腺组织的抗氧化能力可能是治疗乳腺产生氧化损伤的有效方法。研究发现，番茄红素是一种有效对抗反刍动物机体产生氧化损伤的潜在治疗剂，番茄红素的抗氧化潜力源于其直接清除活性氧和刺激内源性细胞防御系统的能力[41]。NFE2L2-ARE 信号通路在维持细胞氧化还原平衡中起着关键作用，也是维持细胞氧化还原平衡中非常重要的一条信号通路。本课题组研究发现，NFE2L2 参与促进奶牛乳腺上皮细胞的抗氧化潜能，番茄红素是一种非常有效的NFE2L2 激活剂，可激活NFE2L2 的表达进而激活NFE2L2-ARE 信号通路减轻机体产生的氧化损伤，且NFE2L2 的敲除可抑制番茄红素的抗氧化作用，进一步表明NFE2L2 是上调抗氧化酶表达的中心[30，41]。氧化应激条件下番茄红素可减弱自由基对奶牛乳腺上皮细胞核内NFE2L2 表达、ARE 荧光强度、II 相解毒酶HMOX1 和NQO1 的mRNA 表达水平、抗氧化酶SOD和GSH-Px 活性的抑制作用，清除奶牛乳腺上皮细胞中多余的自由基和ROS的积累，降低脂质过氧化和DNA 损伤而达到降低氧化应激，维持细胞内氧化还原平衡的目的[42-43]，进一步说明番茄红素具有通过激活NFE2L2-ARE 抗氧化信号通路抑制氧化应激诱导的氧化损伤的潜力[44]。

2.3 番茄红素的抗炎和抗凋亡作用

围产期奶牛产生的氧化应激和慢性炎症密切相关，长时间的氧化应激可诱发机体产生炎性反应，氧化应激和炎性反应协同作用又可导致健康障碍的慢性炎症状态永久化[22]。氧化应激和增强的全身炎症反应是导致围产期奶牛代谢性疾病和感染性疾病的常见诱因。过量的活性氧可以激活MAPK炎性通路和NF-κB炎性通路，进而增加促炎细胞因子的表达[45]，过度激活的MAPK炎性通路和NF-κB炎性通路又可导致炎性细胞因子表达的慢性增加[46]。研究发现，奶牛产犊后乳腺上皮细胞内TNF-α和其他促炎细胞因子表达的增强与大肠杆菌性乳房炎的严重程度有关[47]，也就是说氧化应激状态下促炎细胞因子的增多可诱发大肠杆菌性乳房炎，而番茄红素在氧化应激状态下可失活MAPK炎性信号和NF-κB炎性通路的表达并降低促炎细胞因子TNFα、IL-6和IL-1β的表达，进一步表明番茄红素在围产期奶牛乳房炎的治疗中也可能是有效的。

研究还发现，氧化应激除了激活MAPK和NF-κB炎症途径外，还可诱导细胞凋亡[48]。含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase）凋亡途径在控制线粒体内在凋亡途径中起着关键作用[49]。作为凋亡小体复合物的起始caspase 组分，caspase-9 可以被活性氧激活[50]，激活的caspase-9 可启动下游caspase 级联的caspase-3，进而导致细胞凋亡。此外，凋亡途径还包括B 淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）和Bax 家族蛋白。Bcl-2 是一种抗凋亡蛋白，通过抑制氧自由基介导的膜损伤和稳定线粒体膜电位来防止凋亡[51]，Bax 是一种促凋亡蛋白，在调节细胞色素c释放并促进细胞凋亡方面具有重要作用[52]。研究发现番茄红素可下调氧化应激状态下caspase-9、caspase-3 和Bax 的表达，上调Bcl-2 的表达，进一步证实了番茄红素在控制氧化应激诱导的细胞凋亡中的保护作用。此外，研究还发现番茄红素对NFE2L2抗氧化信号通路的激活减弱了围产期奶牛乳腺上皮细胞的炎症反应和凋亡[53]，而氧化应激状态下敲除NFE2L2 因子，番茄红素反而不能降低炎症细胞因子的表达和乳腺上皮细胞的凋亡率，进一步证实了番茄红素和NFE2L2 在围产期奶牛的抗氧化反应中的直接作用。

综上分析，番茄红素主要是通过失活NF-κB 炎症通路和caspase/Bax 凋亡通路降低促炎因子TNF-α和IL-1β/6的表达和细胞凋亡率而达到降低细胞炎性损伤，维持细胞内免疫平衡[10，43]。敲除NFE2L2后削弱了番茄红素清除氧化损伤奶牛乳腺上皮细胞内ROS的积累、炎症细胞因子的表达和凋亡的保护作用，这一事实进一步证明了抗氧化转录因子NFE2L2 对于番茄红素在奶牛机体内发挥抗氧化作用机制是必不可少的[10，43]，也就是说番茄红素主要是通过激活NFE2L2-ARE 抗氧化通路、失活NF-κB 通路和caspase/Bax通路进而激活下游抗氧化酶和II相解毒酶活性而发挥抗氧化作用、抗炎作用和抗凋亡作用[43]。

此外，研究发现番茄红素还可通过降低体外培养系统中的应激反应来提高牛胚泡质量[54]，通过提高胚胎对氧化应激的适应能力而提高体外培养过程中牛胚胎的发育潜力[55]。尽管瘤胃微生物可能会代谢番茄红素，但围产期奶牛日粮中添加番茄红素仍可通过瘤胃进入血液降低奶牛血清中脂质过氧化水平、提高总抗氧化能力[56]和调节抗氧化酶表达[57]而发挥一系列的抗氧化作用来调节奶牛泌乳早期的代谢适应性，提高奶牛产奶量和乳房健康，进一步证明了番茄红素可添加到围产期奶牛日粮中作为奶牛植物源性抗氧化剂的来源。有关番茄红素在围产期奶牛上发挥的更深入的抗氧化机制还需做进一步研究。

3 小结与展望

围产期是奶牛机体健康、生产和盈利能力最为关键的时期。围产期的生理变化通常会使奶牛更容易诱发代谢性疾病和乳房炎。乳腺上皮细胞作为乳腺抵御入侵病原体的第一道防线，并在感染开始时起主要作用。尽管与泌乳启动相关的代谢需求的增加提高了泌乳早期奶牛的氧化应激状态，但如果不加控制，长时间的氧化应激被认为是引发乳房炎等感染病的主要因素之一。且长时间的氧化应激会导致代谢应激奶牛的功能失调性炎症反应。番茄红素作为一种来源广泛的具有生物活性的抗氧化剂，具有抗氧化作用和抗炎作用，番茄红素的抗氧化作用不仅仅是通过激活NFE2L2-ARE 通路缓解奶牛氧化损伤的非常有效的活化剂，还具有调节参与细胞炎症和细胞凋亡的氧化还原敏感分子信号通路途径的作用。番茄皮渣是番茄红素的重要来源，番茄皮渣作为番茄加工后的农副产品，有望作为围产期奶牛日粮中的一种重要成分而对产犊后奶牛产生的氧化应激和慢性炎症起到预防和治疗作用。