超高效液相色谱-电化学检测法测定不同产地盐肤木中的酚类化合物

张 萍 胡克特 陈荣祥 顾 丁

（遵义医科大学 基础医学院，贵州 遵义 563000）

盐肤木（Rhus chinensis）又称五倍子树，是我国重要的经济型树种，兼具药用、观赏、工业、日用等价值，也可用于环境修复，对多种重金属尤其是镉(Cd)具有较强的吸附性能[1-2]。盐肤木叶片被瘿绵蚜科（Pemphigidae）蚜虫（Pemphigidae aphids）转寄主寄生后而形成的虫瘿称为五倍子，含有大量的单宁，是重要的资源昆虫产物之一，有染色、解毒、消炎、抗菌的功效[3-4]。盐肤木根部较为发达，常用于治疗胃肠道疾病和泌尿系统疾病，具有抗病毒、抗菌、止泻、抗氧化、抗胆固醇等作用，具有潜在的预防和减轻酒精性脂肪肝的价值[5-6]。因此，盐肤木是很多中成药的组成部分[7-8]。我国的盐肤木主要分布在贵州、陕西、四川、湖北等省份，因生长环境的不同，盐肤木根和五倍子的质量也存在了一定的差异，并且多个研究表明不同地理因素可造成植物中成分含量的差异[9-10]。盐肤木根与五倍子同为盐肤木所产的中药材产品，含有大量单宁及其衍生物，在目前的研究中关于五倍子的成分分析与药理活性研究较多，而盐肤木根却少有人研究，且在药用方面五倍子多用于中药方剂与制剂，而盐肤木根除作为中药材入药以外，还常被添加进药膳食用，并且二者的化学成分以及生理活性差异较大[5]。

植物的化学成分及其活性研究对于其资源开发和保护具有重要意义[11-12]，盐肤木根以及制剂中的化学成份有一定的研究，但多以没食子酸含量为指标，采用高效液相色谱（HPLC）对盐肤木的复方及单味药制剂进行含量测定研究[8]。然而，盐肤木中具有生理活性的成分种类繁多，如酚酸、黄酮、三萜酸、多糖等[13-15]。其中酚类化合物的含量与种类尤其丰富，主要包括没食子酸、苔黑酚及其衍生物如五没食子酰葡萄糖、苔黑酚葡萄糖苷等[16]。因此，单独以没食子酸作为评价其质量的指标，不足以令人信服。也有文献采用分光光度对总酚酸的含量进行测定，但是该方法无法对单个化合物进行定量，也无法详细评价地区间样品的差异[17-19]。因此，以色谱法对盐肤木中的主要化学成分进行分离和检测是评估其质量的有效手段，然而盐肤木中酚类化合物化学性质接近，采用常规的液相色谱进行分离耗时较长，时间和经济成本均较高，所检测指标一般较少[20]，而超高效液相色谱（UPLC）较HPLC具有更高的分离度和灵敏度，通常采用亚2 μm填料色谱柱，可以缩短分析时间，提高分离效率，所以目前越来越广泛用于天然产物成份分离[21]。例如李鸷等[22]采用超高效液相色谱对盐肤木中的8种成分进行了分离，并对福建、广东和安徽等省份的盐肤木进行了测定。相对于光学检测器，电化学检测器（ECD）灵敏度极高，同时具有良好的选择性，在药品和食品质量控制方面发挥重要的作用，尤其适合检测酚类[23]、硫醇和杂环类化合物[24]。由于其仅对具有电化学活性的化合物有响应，因此形成的色谱图干扰较少，基线平稳。酚类化合物具有较强的还原性，直流模式下较低的检测电压即可进行检测，并且该条件下，糖类、有机酸、生物碱类均不干扰检测[9]。因此，本研究以酚类化合物作为检测指标，联合UPLC与ECD用于盐肤木根的成分分析，建立同时测定盐肤木根中9种酚类化合物含量的方法，并对11批盐肤木样品进行聚类分析与主成分分析，为各地盐肤木根的品质评估提供参考依据，为该药材指标性成分的选择、质量标准提升和全面质量控制提供参考，促进全国盐肤木产业的健康发展。

1 材料与方法

1.1 实验材料

盐肤木根样品采集自浙江、广东、福建、贵州、广西等11个地区，用自来水清洗干净，置于干燥箱50 ℃烘干，粉碎后过60目筛备用。

1.2 实验方法

1.2.1 样品溶液的制备

取处理好的样品粉末，用电子天平（精确至0.1 mg）精确称取0.1 g，加80%甲醇5 mL，超声50 min，得到的萃取液取2 mL离心，上清液过0.22 μm有机滤膜后进样分析。

1.2.2 标准品储备液的制备

没食子酸、苔黑酚葡萄糖苷、表没食子儿茶素、没食子酸甲酯、苔黑酚、表没食子儿茶素没食子酸酯、没食子酸乙酯、表儿茶素没食子酸酯、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖9种酚类化合物标准品准确称取一定质量，用甲醇溶解、定容，配制成1 mg/mL储备液于-20 ℃储存备用，使用前将标准储备液用甲醇稀释成所需浓度，标准品均购自阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2.3 UPLC测定盐肤木根中酚类化合物的含量

采用UltiMate 3000 Bio-RS型超高效液相色谱仪（赛默飞世尔科技有限公司，美国）进行色谱分离。色谱柱为ACQUITY UPLC HSS T3柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流动相条件为50 mmol/L柠檬酸盐溶液（pH 2.9）与甲醇，按以下梯度程序洗脱：0～14 min，10%～35% 甲醇；之后采用40% 甲醇冲洗2 min后回到初始梯度并平衡4 min，柱温30 ℃，进样体积1 μL。3000 RS 电化学检测器（赛默飞世尔科技有限公司，美国）检测电压为600 mV，3400 RS 二极管阵列检测器（赛默飞世尔科技有限公司，美国）检测波长275 nm。

1.2.4 测定方法验证

准确移取不同体积的盐肤木标准品储备液（1 000 mg/L），加甲醇稀释，分别配制浓度为0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00、20.00 mg/L的标准品工作溶液，按照优化后的色谱条件进行检测，以峰面积作为纵坐标，样品浓度作为横坐标，计算线性方程以及相关系数。

1.3 数据分析

使用SPSS 24.0统计软件进行聚类分析、主成分分析和因子分析，将数据进行分类、降维得出结果。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的选择及优化

2.1.1 流动相条件的优化

因电化学检测器必须在一定的缓冲盐中运行检测，而酸性环境有利于酚类化合物的分离。因此，以50 mmol/L柠檬酸盐为缓冲溶液，由pH 7开始逐步降低其pH，当pH下降到3以下时，9种酚类化合物峰形良好，最终确定以50 mmol/L柠檬酸盐（pH 2.9）-甲醇作为本实验的流动相检测条件，进行梯度洗脱。

2.1.2 检测电压的选择

本实验前期将流动相条件进行了优化，在此基础上将检测池的电压由低到高以50 mV为间距，从0 mV升高至700 mV。将同一份样品重复进样，考察由检测电压的变化引起的9种酚类化合物的响应值的变化，以确定最佳的电压检测条件。由图1可知，当电压低于600 mV时，各成分的峰响应值随电压增大而增大，600～650 mV趋于平缓且大部分酚类化合物在600 mV时响应值最高，至650 mV以后，峰面积有下降趋势，而噪音快速增加。故选择600 mV作为盐肤木中各成份的检测电压。

图1 不同检测电压下酚类化合物的响应变化趋势Fig.1 Trend of peak area of phenolic compounds under different potentional

2.2 方法验证与样品含量检测

2.2.1 方法准确性验证

9种酚类化合物线性关系良好，相关系数（R2）均大于0.999 0。以3倍信噪比计算检测限，不同化合物的检测限在1.8～16.9 μg/L之间，见表1。

表1 盐肤木中9种酚类化合物线性关系考察结果Table 1 Linear relationship of 9 phenolic compounds in R.chinensis

按优化后的色谱条件对9种酚类化合物混合标准溶液连续进样6次，结果表明9种酚类化合物的峰面积的相对标准偏差（RSD）为0.53%～0.84%，精密度良好。按试验方法对同一份样品进行分析，平行测定6次，峰面积的RSD为0.72%～3.07%，重复性良好。按试验方法对盐肤木样品进行处理，4 ℃存储，分别于0、2、4、8、10、12 h进行测定。结果表明峰面积的RSD为1.03～2.16%，说明样品在4 ℃存储具有较好的稳定性。按试验方法对已知浓度样品进行加标回收试验，加标水平1∶1，重复5次，计算得出的9种酚类化合物的回收率为95.3%～102.1%，RSD小于5%，说明本方法准确可靠。

2.2.2 样品含量检测

将11个地区的盐肤木样品产地信息进行记录，如表2，采用优化的提取条件和色谱条件对盐肤木样品进行检测，结果见表3。标准品和实际样品的色谱图见图2。

表2 11个样品产地地理信息汇总Table 2 Geographic information summary of 11 samples

表3 11批盐肤木样品中酚类化合物含量测定结果Table 3 Determination of phenolic compounds in the samples of R.chinensis from 11 regions mg/g

图2 标准品与样品色谱图Fig.2 Chromatograms of standard solution and sample

2.3 聚类及主成分分析

为了将11批盐肤木样品进行归类分析，使用软件SPSS 24.0，采用系统聚类法，以组间联接法为聚类方法，以平均欧式距离为聚类距离对11批省份的盐肤木样品进行聚类分析（如图3）。聚类 结 果 主 要 分 成3类：S2、S4、S10、S11为 第1类；S1、S5、S6、S7、S8、S9为第2类，S3为单独一类。

将样本聚类整理分析后，继续使用SPSS 24.0数据统计软件、以9种酚类化合物以及对应的矩阵进行主成分分析和因子分析。数据经KMO（0.687）与巴特利特球型度检验后确定适合进行主成分分析，因此取特征值＞1且统计显著水平的数据作为主要成分，可将盐肤木样品的9种酚类化合物分为3个主要成分，如表4。利用得到的数据绘制散点图，发现大部分样本与主成分1较为靠近，见表5、图4。

图3 11批盐肤木样品中酚类化合物含量的聚类分析树状图Fig.3 Cluster analysis tree diagram of the samples of R.chinensis from 11 regions

表4 3个主成分因子的特征值和方差贡献率Table 4 Eigenvalues and variance contribution rates of 3 principal components

表5 初始因子载荷矩阵Table 5 Loading factor of principal components

图4 11批盐肤木样品中酚类化合物含量的PCA分析Fig.4 Principal component analysis of phenolic compounds in the samples of R.chinensis from 11 regions

2.4 UPLC-ECD与其他方法的比较

盐肤木中含有大量酚类化合物，多采用紫外检测器在波长275 nm附近检测[22]。将同一样品在相同色谱条件下，将电化学检测器和紫外线检测器形成的的色谱图进行对比，图5为样品采用DAD检测的色谱图，样品与图2b为同一样品，二者的色谱条件除检测器外完全一致，可见电化学检测的出峰效率和峰型状态都比DAD检测器好。电化学检测器灵敏度高，快速准确，更有利于盐肤木各成份的分离检测。

图5 UPLC-DAD色谱图Fig.5 Chromatogram of UPLC-DAD

3 结论与讨论

盐肤木生长在在全年平均气温8～20 ℃，年降水量600 mm以上，质地为沙壤、中壤，土壤pH值为微酸、微碱性的环境条件中。不同产地的盐肤木因为地理环境的不同，酚类化合物的含量也有了差异。我们以酚类化合物作为指标，对11个地区的盐肤木样品进行检测，结果发现S3、S10、S11样本含量较高，分别含有18.944、11.362、10.178 mg/g。9种酚类化合物在11批盐肤木样本中的均值以没食子酸最高，含有2.656 mg/g。主成分分析将样品分成3个主要成分，主成分1的信息主要来自没食子酸、表没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖，主成分2的信息主要来自苔黑酚葡萄糖苷、没食子酸甲酯、没食子酸乙酯，主成分3的信息主要来自表没食子儿茶素、苔黑酚，说明样品间的生长习性和品质有一定的相似性，这一结果对于盐肤木根质量的地区选择与归类有一定的参考依据。

综上所述，本实验建立了UPLC-ECD同时测定没食子酸、苔黑酚葡萄糖苷、表没食子儿茶素、没食子酸甲酯、苔黑酚、表没食子儿茶素没食子酸酯、没食子酸乙酯、表儿茶素没食子酸酯、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖等9种酚类化合物含量的方法，并比较了11个地区盐肤木样品中9种酚类化合物的含量。该方法快速简便准确，灵敏度高，重复性好，可为盐肤木药材药理质量控制提供参考依据。