针叶挥发物组分对楚雄腮扁叶蜂引诱活性的分析

马惠芬 闫争亮 毛云玲 刘 凌

（云南省林业和草原科学院，云南 昆明 650201）

楚雄腮扁叶蜂（Cehpalica chuxiongnica），隶属膜翅目（Hymenoptera）扁叶蜂科（Pamphiliidae），是云南松（Pinus yunnanensis）、华山松（Pinus armandii）等松属树种的一大食叶害虫，也危害滇油杉（Keteleeria evelyniana）等其他松科植物[1]。该虫以幼虫取食松树叶片，造成树木畸形、生长缓慢，为害严重时导致寄主死亡；其幼虫取食吐丝形成的灰白色幕巢也影响观瞻。同时，楚雄腮扁叶蜂为害，造成树势衰弱，易引发小蠹虫等次期性害虫的侵害[2]。自1997年在楚雄市境内发现该虫危害云南松幼林以来，先已扩散到了楚雄、曲靖、文山、红河和昆明等州市，发生面积达近万公顷。危害特点是产卵雌蜂的聚集产卵和低龄幼虫的群集取食，当虫口密度较小时，一般有般2～4头成虫产卵于同一松梢上，虫口密度较大时则有多达18头雌蜂群集于同一个松梢上产卵[3]。楚雄腮扁叶蜂幼虫取食松针时会很快产生幕巢保护，而老熟幼虫长期（每个世代16个月左右）在树冠下10～30 cm的土层内生存[2]。化学防治施药时机难以把握，防治难度较大。目前，楚雄腮扁叶蜂的有效防治以摘除产卵松针、摘除虫巢、翻挖受害木树冠下越冬滞育幼虫等人工防治为主。楚雄腮扁叶蜂种群数量激剧增加、分布范围不断扩大、危害程度越来越重，现有防控措施投入巨大，收效较小。

昆虫化学信息物质已被应用到许多农林害虫的监测和防控中[4-8]。基于信息化学物质的监测和诱杀，是方法简便、成本较低的楚雄腮扁叶蜂防控策略，具有较好的应用前景。通过前期研究发现，寄主松树的针叶粗提物对楚雄腮扁叶蜂雄蜂和抱卵雌蜂具有明显的引诱作用[9]。为了进一步研究寄主针叶挥发物对楚雄腮扁叶蜂行为的影响，对云南松针叶的主要挥发物组分的引诱活性进行了研究。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试虫

供试昆虫采集自云南省禄丰县和平村云南松林地内，在楚雄腮扁叶蜂即将羽化出土的季节（5月中旬），踏查松林内是否有楚雄腮扁叶蜂为害。选择树冠下散落有前一年度老熟幼虫下树入土前遗留的虫巢的松树，在树干周边约1 m的地面挖掘深度约20 cm，收集经过越冬即将羽化的的楚雄腮扁叶蜂蛹或者已经羽化尚未出土的成虫，带回室内。将浅绿色蛹放入直径25 cm，高15 cm的透明塑料圆盒内，覆盖湿润的原土待其羽化。采集的成虫则分别雌雄虫（雌蜂前胸背板为锈红色，而雄蜂则为黑色）则直接放入40 cm×40 cm×40 cm的养蜂笼内，喂以10%的蔗糖水，饲养备用；自然室温20～27 ℃，相对湿度（60±10）%。

1.1.2 粗提物的制备

采用简便的蒸馏萃取法提取树叶挥发油。将新鲜树叶剪下后，迅速放入磨口玻璃瓶中密封，将玻璃瓶放入加有医用冰袋的保温瓶中。带回实验室后，用医用小刀将韧皮部剪碎为2 mm×2 mm的碎屑；称取100 g放入500 mL的圆底烧瓶中，加入200 mL自来水和50 mL三氯甲烷；加热回流2 h后，冷却至室温。分离出有机层后，以玻璃棉过滤掉不溶物；滤液以无水硫酸钠干燥。然后以旋转蒸发仪出去溶剂，得到粗提物，于冰箱中4 ℃下保存，备用。

1.1.3 化合物

水蒸气蒸馏法得到的云南松针叶挥发物[10]，与利用顶空收集法收集到的针叶挥发物[11]在组成和比例上差别很大。综合考虑云南松针叶自然状态下挥发物的释放情况，选择了如表1所示的6种化合物，测试了其对楚雄腮扁叶蜂的引诱活性。

表1 标准化合物纯度及来源Table 1 Purity and sources of compounds

1.1.4 诱芯和诱捕器

林间试验用诱捕器即为黄色粘虫板（25 cm×30 cm）。

诱芯：以反口小乳胶塞（The west company，Phoenixville，PA）为载体。将松针粗提物以及标准化合物配制成100 μL/mL的正己烷溶液，取溶液50 μL滴在乳胶塞的凹面部分，室温下待溶剂挥发后，再滴加50 μL溶液。这样每个诱芯载有引诱物质10 μL。在密封塑料袋中置于冰箱中保存，待用。

1.2 试验方法

1.2.1 林间引诱试验

化合物及粗提物的林间诱捕试验在2016年8月3日至8日进行，试验地点设置在云南省禄丰县和平村。该村地处东经102°12′，北纬25°12′，海拔1 820 m，年平均气温16.2 ℃，年降雨量930 mm，寄主植物是云南松和云南油杉。自2012以来，云南松受害率达100%，云南油杉受害率达60%。

将诱芯用细铁丝固定在黄色粘虫板上缘中间位置，即为诱捕装置。将诱捕装置悬挂于云南松约1.5～2.0 m高度的侧枝上，诱捕装置之间间距最小10 m。每个样品设6个重复，以未带诱芯的黄色粘虫板为对照。7 d后检查诱捕情况（雌蜂前胸背板为锈红色，而雄蜂则为黑色），并记录诱捕量。

1.2.2 室内趋向试验

室内趋向试验于2016年6月进行。试虫采集自云南省禄丰县和平村进行。粗提物和标准化合物浓度为10 μL/mL。

利用“Y”形嗅觉仪法，参照张同心等[12]的方法测试。测试时，在一个球形管内放入滴有10 μL溶液纸条（2.0 cm×0.5 cm）作为气味源（0.1 μL化合物），另一个球形管内放入滴有10 μL的相应溶剂的滤纸条作为对照。试验时，将试虫放入“Y”型嗅觉仪主管入口处，用黑色聚乙烯膜覆盖整个嗅觉仪，以免由于趋光性而影响实验结果。启动真空泵，调节“Y”型嗅觉仪的主管内气流流量为100 L/h。引入试虫2 min后检查试虫趋向反应，如果试虫进入作为气味源的支管或梨形干燥管，记为正趋向；试虫进入作为对照的支管或梨形干燥管，记为负趋向，如果试虫停留在“Y”型管的主管中则记为无选择。用正趋向试虫数占被测试的试虫总数的百分数来表示被测试样品的活性（趋向率）。每次测试使用同一批从野外采回的经过饲养的楚雄腮扁叶蜂成虫；每个气味源测试5次，每次测试时将10头雌蜂依次试验；每测试5头，调换1次气味源。对经过1轮测试的试虫不再使用。

1.3 数据处理

以Excel 2007进行数据处理并作图，以单因素方差分析进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 室内趋向行为

室内趋向行为试验结果见图1～2。楚雄腮扁叶蜂雌蜂对针叶粗提物、（-）-β-蒎烯、月桂烯、β-石竹烯表现出明显的趋向反应，但（+）-α-蒎烯、（+）-柠檬烯则没有表现出明显的引诱活性（图1a）。针叶粗提物、（+）-α-蒎烯、（-）-β-蒎烯、β-石竹烯对雄蜂具有引诱活性（图1b）。（+）-α-蒎烯对雌蜂没有表现出引诱活性，而对雄蜂有效；月桂烯则相反，对雌蜂表现出引诱活性。

图1 楚雄腮扁叶蜂雌雄蜂对针叶粗提物及挥发物主要组分的趋向行为Fig.1 Taxis responses of male and female C.chuxiongnica to crude extracts and main volatile constituents of needle

2.2 林间诱捕结果

在林间诱捕试验中，与未设置诱芯的黄色粘虫板相比较，所有被测试的物质都诱捕到了一定量的楚雄腮扁叶蜂（图2）。但被试物质对楚雄腮扁叶蜂雌、雄虫的诱捕量有差异。以针叶粗提物、（+）-α-蒎烯、（-）-β-蒎烯、月桂烯、β-石竹烯等都诱捕到了比楚雄腮扁叶蜂雌蜂较多的雄蜂，但（+）-柠檬烯对楚雄腮扁叶蜂雌雄蜂的诱捕量无明显差异（图3）。

图2 针叶粗提物及挥发物主要组分的楚雄腮扁叶蜂的林间平均诱捕量Fig.2 Mean numbers of C.chuxiongnica captured by crude extracts and main volatile constituents of needle

图3 楚雄腮扁叶蜂雌雄蜂林间平均诱捕量比较Fig.3 Comparison of catch numbers of male and female C.chuxiongnica

3 结论与讨论

室内趋向的试验结果（图1、图2）显示，（-）-（-）-β-蒎烯、月桂烯、β-石竹烯都引起楚雄腮扁叶蜂雌蜂明显的趋向反应；（-）-β-蒎烯、β-石竹烯同样对雄蜂具有引诱活性。针叶中含量较高的（+）-α-蒎烯[11]没有表现出对楚雄腮扁叶蜂雌蜂明显的引诱活性，但引起雄蜂的明显趋向反应；月桂烯可引发雌蜂明显的趋向反应，对雄蜂无效。由此可见，寄主针叶的挥发物对楚雄腮扁叶蜂雌蜂、雄蜂都具有一定的引诱作用，但雌雄峰对针叶挥发物的组分的嗅觉反应存在一定差异。

从林间诱捕的结果看（图3），除（+）-柠檬烯外，（+）-α-蒎烯、（-）-β-蒎烯、月桂烯、β-石竹烯诱捕到了明显多于空白对照的楚雄腮扁叶蜂，这与室内趋向反应的试验结果一致。同时，（+）-α-蒎烯、（-）-β-蒎烯、月桂烯、β-石竹烯等，诱捕到了较雌蜂为多的雄蜂（图3）。楚雄腮扁叶蜂也严重危害华山松，华山松针叶粗提物对楚雄腮扁叶蜂具有明显的引诱作用[13]。由此看出，楚雄腮扁叶蜂依赖来自寄主针叶的挥发物作为其寻找寄主的线索，松树针叶挥发物的各种组成都在楚雄腮扁叶蜂寻找寄主中发挥作用。

但在室内趋向行为测试中没有引起楚雄腮扁叶蜂雄蜂明显趋向反应的月桂烯也诱捕到了明显多于空白对照的雄蜂。室内试验中，雄蜂没有对月桂烯表现趋向反应，但可引起雌蜂的明显趋向反应；林间也表现对雌蜂的明显引诱作用，同时诱捕到大量的雄蜂。这说明，可能月桂烯本身并不对雄蜂产生引诱左右，而是由于诱捕装置上先前捕获的雌蜂对雄蜂产生的引诱作用。

本试验中，针叶粗提物的对楚雄腮扁叶蜂雌蜂林间诱捕量并不比单独的单萜烯（（-）-β-蒎烯、β-石竹烯）诱捕量大。这可能是由于针叶粗提物中各个单萜烯的相对含量[10]与林间自然状态下针叶释放的单萜烯的相对比例[11]不一致的缘故。针叶粗提物并没有表现出对楚雄腮扁叶蜂雌蜂引诱的增效作用。

自然界中大部分昆虫主要依靠嗅觉来完成其寄主植物的搜索与识别过程，进而完成其取食、交配和产卵等行为。其中，寄主植物气味一般对昆虫产生引诱或寄主定位的影响[14]。林木害虫同样依靠寄主挥发物、非寄主挥发物来作出是否降落于寄主树上[15]。针叶树的单萜烯是小蠹科树皮蠹虫寻找适宜寄主的重要的依据[16-17]；寄主挥发物在天牛类[18-19]、象甲类[20]昆虫的寄主选择中也发挥重要作用。欧洲新松叶蜂雌蜂（Neodiprion sertifer）可辨别意大利五针松（Pinus pinea）与欧洲赤松（Pinus sylvestris）和欧洲黑松（Pinus nigra），进而避免在意大利五针松上产卵[21]，欧洲赤松叶锋（Diprion pini）雌蜂也可辨别欧洲赤松（Pinus sylvestris）、欧洲黑松（Pinus nigra）与北美短叶松（Pinus banksiana）、北美乔松（Pinus strobus）[22]，而将选择欧洲赤松和欧洲黑松作为其产卵寄主[23]。研究也发现，楚雄腮扁叶蜂雌蜂选择云南松、华山松作为其产卵寄主，而避免在滇油杉（Keteleeria evelyniana）上产卵[9]。针叶挥发物（+）-柠檬烯是决定欧洲新松叶蜂对意大利五针松与欧洲赤松和欧洲黑松进行取舍的重要组分。意大利五针松释放较高浓度的（+）-柠檬烯，而欧洲赤松释放的月桂烯浓度较高；较高浓度的（+）-柠檬烯对欧洲新松叶蜂具有引诱活性，而浓度较低时则表现驱避活性[21]。北美短叶松、北美乔松针叶挥发物中含有较高浓度的（+）-柠檬烯、β-蒎烯和月桂烯[22]。单萜烯的浓度会随离气味源的远近而变化，不能提供寄主树的准确信息；每种松树针叶挥发物中各种单萜烯的比例基本上是不变的，而不同树种针叶的单萜类挥发物比例存在差异，这也许是楚雄腮扁叶蜂寻找适宜寄主的准确依据。室内趋向测试只是试验了单萜烯刺激量为0.1 μL情况下试虫的趋向反应；这些化合物的引诱活性在其他剂量下是否会改变，尚待进一步研究。